<bold>3</bold>株高效除磷细菌的分离鉴定及磷去除途径分析

王雨，金鹏康，任童，石烜，金鑫; WANG Yu; JIN Pengkang; REN Tong; SHI Xuan; JIN Xin

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3株高效除磷细菌的分离鉴定及磷去除途径分析 PDF

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王雨 ¹
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金鹏康 ^1,2
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任童 ¹
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石烜 ²
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金鑫 ²

1. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院，西安 710055； 2. 西安交通大学人居环境与建筑工程学院，西安 710049

中图分类号： X703.1； X172

最近更新：2023-04-17

DOI：10.11835/j.issn.2096-6717.2022.063

摘要

从稳定运行的厌氧/好氧/缺氧序批式反应器（A/O/A-SBR）中筛选分离得到3株高效除磷细菌，通过形态观察、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析进行物种分析，确定3株细菌分别为不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）和肠杆菌属（Enterobacter），NCBI保存登录号分别为OL519151、OL519152、OL519153。以pH值、温度及碳源种类作为影响因子，分析细菌生长特性和除磷率，同时分析无机磷和有机磷在细菌胞内、溶解性微生物产物（SMP）及胞外聚合物（EPS）中的分布转化规律。结果表明：在最佳环境条件下，Acinetobacter sp. PK01、Klebsiella sp. PK02和Enterobacter sp. PK03菌株的最高除磷率分别达到89.4%、85.43%和76.95%。其中，Acinetobacter对环境中磷的去除主要依靠吸收胞外无机磷，并以多聚磷酸盐的形式储存于体内，该途径去除了基质中54.93%的磷；Klebsiella对环境中磷的去除主要依靠EPS合成和吸附作用，该途径去除了基质中47.18%的磷；Enterobacter主要依靠多聚磷酸盐和EPS的合成作用，去除了基质中48.32%的磷。

关键词

除磷菌; 不动杆菌; 克雷伯菌; 肠杆菌; 磷转化分布

现代污水生物除磷法是利用聚磷菌超量摄取磷酸盐，并以多聚磷酸盐的形式储存在其体内，通过排放剩余污泥以实现磷的去除^[

1]。在Greenburg等1955年首次提出活性污泥法除磷之后，1975年Fuhs等^{[参考文献 2

百度学术}2]系统性提出了聚磷菌（PAOs）的厌氧释磷—好氧过度摄取磷酸盐生物机制。自此，强化生物除磷（EBPR）工艺的研究得到迅速发展，例如，现有的A/O^{[参考文献 3

百度学术}3]、AA/O^{[参考文献 4

百度学术}4]、UCT^{[参考文献 5

百度学术}5]、Bardenpho^{[参考文献 6

百度学术}6]及Phostrip等工艺^{[参考文献 7

百度学术}7]。Candidatus Accumulimonas和Candidatus Accunulibacter一直被认为是污水处理系统中典型的PAOs^{[参考文献 8

百度学术}8]，Wu等^{[参考文献 9

百度学术}9]对23个国家269个污水处理厂活性污泥样本的微生物群落进行了分析，上述两种细菌都被认定为活性污泥微生物群落28个核心物种之一。然而，随着分子生物学研究的进步，研究者已经从活性污泥中筛选得到了多种具有除磷功能的微生物，包括Acinetobacer^{[参考文献 10

百度学术}10]、Pseudomonas^{[参考文献 11

百度学术}11]、Alcaligenes^{[参考文献 7

百度学术}7]、Tetrasphaera^{[参考文献 12

百度学术}12]等，说明以往的研究可能忽视了其他微生物在活性污泥中对磷的去除作用。

鉴于此，笔者从实验室活性污泥中筛选出3株具备高效除磷能力的细菌，考察环境因素对菌株除磷能力的影响，并对其除磷过程中磷的转化分布规律进行全面分析。

1 试验材料与方法

1.1 样品来源

取稳定运行的实验室厌氧/好氧/缺氧反应器（A/O/A-SBR）中的活性污泥作为样品。反应器SRT控制在16~20 d，DO＜1.0 mg/L，MLSS保持在（3 120±200）mg/L，反应器温度控制在26 ℃。试验用水为人工配制的模拟生活污水，无水乙酸钠作为碳源，氯化铵作为氮源，磷酸二氢钾作为磷源，维持主要水质指标COD为175 mg/L，TN为50 mg/L，TP为6 mg/L。稳定期出水COD平均为29.06 mg/L，TN为14.32 mg/L，TP为0.27 mg/L。详细运行情况见文献[

13]。

1.2 培养基

Luria broth（LB）培养基（L）：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值为7.0~7.2，固态培养基加20 g琼脂粉^[

14]。

富集培养基（L）：CH₃COONa 5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，CaCl₂ 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 2.0 g，KH₂PO₄ 8.77~87.74 mg，微量元素1 mL，pH值为7.2~7.4。

筛选培养基（L）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH₂PO₄ 65.81 mg，琼脂20 g，pH值为7.2~7.4^[

15]。

缺磷培养基（L）：CH₃COONa 3.23 g，NH₄Cl 152.80 mg，MgSO₄·7H₂O 81.12 mg，K₂SO₄ 17.83 mg，CaCl₂·2H₂O 11 mg，PIPES缓冲液7 g，微量元素1 mL，pH值为7.2~7.4。

富磷培养基（L）：CH3COONa 3.23 g，NH₄Cl 305.52 mg，MgSO₄·7H₂O 91.26 mg，KH₂PO₄ 87.74 mg，CaCl₂·2H₂O 25.68 mg，PIPES缓冲液8.5 g，微量元素1 mL，pH值为7.2~7.4^[

16]。

微量元素（L）：CuCl₂·2H₂O 35 mg，NiCl₂·6H₂O 36 mg，MgSO₄·7H₂O 5 000 mg，FeCl₂·4H₂O 6 000 mg，CoCl₂·4H₂O 880 mg，H₃BO₃ 100 mg，ZnSO₄·7H₂O 100 mg和 MnCl₂·4H₂O 500 mg^[

13]。

1.3 菌种富集与筛选

1.3.1 菌种富集驯化

从A/O/A-SBR中取10 mL活性污泥转移至装有90 mL超纯水和玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡以打碎活性污泥。以8 000 r/min 离心5 min后弃掉上清液，用超纯水水洗3次。处理后的样品转入装有100 mL富集培养基的锥形瓶中，在30 ℃下以150 r/min振荡培养。每12 h取10 mL菌悬液转入新的装有90 mL富集培养基的锥形瓶中，培养基磷梯度变化为2、5、8、10、15、20 mg/L（以P浓度计）。

1.3.2 菌种筛选与纯化

取1 mL富集培养基中的菌悬液，采用稀释涂布法分别在筛选培养基上培养3~5 d，挑取形态清晰的单菌落纯化，直至菌落特征一致，无异常菌落出现，最后划线接种至LB固体培养基中保存备用。

对各菌株进行除磷率分析：挑取菌种接种至50 mL LB培养基中过夜培养，以8 000 r/min离心后用超纯水洗涤3次，重悬菌种并置于50 mL缺磷培养基中预培养，即30 ℃、150 r/min培养12 h。收集菌液在8 000 r/min离心后用超纯水洗涤3次，重悬菌种并按照5%接种至50 mL 富磷培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养。整个过程在无菌条件下进行，每2 h取2 mL样品先测定OD₆₀₀，经过0.45 μm滤膜过滤后用于后续磷分析，试验重复3次。

1.4 菌株生长特性

1.4.1 菌株的生理生化特性

菌株生理生化特性的鉴定方法参照文献[

17]。

1.4.2 菌株生长的环境条件

菌种预培养后按照5%接种至50 mL富磷培养基中，控制培养条件：pH值（5、6、7、8、9），温度（20、25、30、35、40 ℃），碳源（乙酸钠、丙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠和葡萄糖）。每4 h取2 mL样品先测定OD₆₀₀，经过0.45 μm滤膜过滤后用于后续磷分析，试验重复3次。

1.5 16S rRNA基因序列的克隆与分析

选取目标菌种，使用TSINGKE细菌DNA提取试剂盒提取菌株总DNA，利用细菌菌种鉴定通用引物27F/1492 R进行PCR扩增，通用引物序列为（27F:5’- AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; 1492R:5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。提取测序过程全部交由北京擎科生物科技有限公司完成。测序结果提交至GenBank，并进行BLAST比对，采用Clustal X进行多序列比对，使用MEGA4.1软件中的NJ法构建系统发育树。

1.6 菌株的磷去除途径分析

菌种预培养后按照5%接种至50 mL富磷培养基中，设置平行培养基共24个，pH值控制在7.0~7.2，温度控制在30 ℃，碳源采用乙酸钠。取样：将50 mL培养液转移至无菌离心管中，在4 ℃ 下以10 000 r/min离心10 min，提取上清液测定COD、乙酸、无机磷（IP）及总磷（TP）。其中，TP与IP浓度差值代表OP浓度，IP浓度代表基质（培养基固定成分）中的P浓度（C_BS-IP），OP浓度代表SMP中的P浓度（C_SMP-OP）。剩余底物利用0.01 mol/L NaCl重悬至50 mL后在60 ℃水浴加热20 min，在4 ℃以10 000 r/min离心10 min，收集上清液测定COD来表征EPS的量，并测定IP和TP。这里的IP浓度代表EPS中IP浓度（C_EPS-IP），OP浓度代表EPS中OP浓度（C_EPS-OP）。离心底物利用0.01 mol/L NaCl重悬至10 ml后以120 W在超声破碎仪中破碎10 min，取1 mL收集液用于测定IP和TP。这里的IP浓度代表细菌胞内IP浓度（C_IN-IP），OP浓度代表细菌胞内OP浓度（C_IN-OP）。根据浓度计算培养基中各部分P质量变化，各部分P质量与培养基中TP质量的比值代表了不同途径下的除磷率，从而分析细菌培养过程中P的转化分布。培养基中TP质量计算式为

M_TP=M_BS-IP+M_SMP-OP+M_EPS-IP+M_EPS-OP+ M_IN-IP+M_IN-OP

式中：M_TP为培养基中总磷质量；M_BS_-_IP为培养基基质中无机磷质量；M_SMP_-_OP为培养基SMP中有机磷质量；M_EPS_-_IP为培养基EPS中无机磷质量；M_EPS_-_OP为培养基EPS中有机磷质量；M_IN_-_IP为培养基细菌胞内无机磷质量；M_IN_-_OP为培养基细菌胞内有机磷质量。

剩余收集液过0.45 μm滤膜后测定细菌干重。上述取样测定过程每4 h进行一次，试验重复3次。

1.7 分析方法

常规分析采用国标法，IP分析采用钼锑抗光度法，TP分析采用过硫酸钾消解钼锑抗光度法，通过TP与IP的差值测定OP的含量^[

18-19]。根据之前的研究，COD被用作表示SMP和EPS总量的单位，其中SMP的量为水体中总COD减去乙酸钠的COD当量^{[参考文献 13

百度学术}13, 20]，COD分析采用快速密闭催化消解分光光度法^{[参考文献 18

百度学术}18]，乙酸钠通过HPLC(Japan)和Aminex HPX-87H色谱柱进行定量^{[参考文献 21

百度学术}21]。利用Excel完成OD₆₀₀和除磷率之间的相关性分析。

2 试验结果与讨论

2.1 菌株的筛选

从筛选培养基中分离得到6株不同形态的细菌，分别以1~6标记，对这6株细菌进行吸磷试验。先将6株菌种置于缺磷培养基中进行预培养，目的是先消耗细菌体内的磷酸盐，然后再转接到富磷培养基中，富磷培养基中的磷浓度达到了20 mg/L左右（一般生活污水中磷浓度小于10 mg/L）。所有细菌的除磷率及OD₆₀₀如图1所示，可以看出，5号菌株的除磷率最高，16 h内除磷率已经达到了78.89%，24 h后除磷率达到了88.22%。其次是2号和6号，24 h的除磷率都达到了75%以上。

图1 菌株1~6的除磷率和OD₆₀₀

Fig. 1 Phosphorous removal rate and OD₆₀₀ of strains1-6

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的生理生化特性

选取除磷率最高的3株细菌，分别为2、5、6号，根据除磷率分别命名5号为PK01，2号为PK02，6号为PK03，并对3株菌种进行生理生化分析，如表1所示。

表1 细菌PK01, PK02, PK03的生理生化特征

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain PK01, PK02 and PK03

项目	PK01	PK02	PK03
菌落形状	圆形扁平	圆形突起	圆形小突起
菌落颜色	黄色	乳白色	淡黄色
菌落透明度	半透明	半透明	半透明
菌落表面	光滑	光滑	光滑
菌落黏度	较黏	较黏	较黏
细胞形态	杆状	杆状	杆状
氧化酶试验	+	-	-
甲基红试验	+	-	+
V-P试验	+	+	+
明胶液化试验	+	-	-
柠檬酸盐利用试验	+	+	+
糖发酵试验	+	+	+
硝酸盐还原试验	+	+	+
吲哚试验	+	-	-
淀粉水解试验	-	-	-
产硫化氢试验	+	-	-

2.2.2 16S rRNA基因测序分析

菌株PK01、PK02和PK03的16S rRNA基因扩增片段长分别1357、1451、1532 bp。通过在GenBank中进行Blast比对，菌株PK01与Acinetobacter tandoii（KU877626.1）同源性达到了99%，PK02与Klebsiella pneumoniae（MN989349.1）同源性达到了99%，PK03与Enterobacter cloacae（KJ541760.1）同源性达到了99%。Acinetobacter、Klebsiella和Enterobacter同属于γ-变形菌纲，但Acinetobacter属于莫拉菌科，一直被认为是聚磷菌的主要菌属^[

22]，然而Klebsiella和Enterobacter属于肠杆菌科，有关聚磷功能的研究鲜有报道。通过下载与各菌株同源性较高的16S rRNA基因序列进行ClusrerW聚类分析，使用MEGA4.0构建系统发育树，如图2所示。根据生理生化分析和16S rRNA基因序列比对结果，将3株细菌分别命名为Acinetobacter sp.PK01、Klebsiella sp.PK02 和Enterobacter sp.PK03。

图2 3株细菌的系统发育树

Fig. 2 The phylogenetic trees of three strains

2.3 菌株除磷环境条件

2.3.1 pH值对3株细菌生长及除磷率的影响

初始pH值会影响细胞在培养基中的氧化还原电位和带电状态，从而影响微生物对营养物质的吸收和酶促反应，因此，pH值的变化会对菌株的除磷效果产生影响^[

16]。由图3可以看出，菌株PK01、PK02和PK03都能够在pH值为7~9的条件下生长，并且具有较好的除磷效果，除磷率与OD₆₀₀的相关系数R²分别为0.924 3、0.939 2和0.966 3，表明3种细菌可以较好地适应中性和碱性环境，同时表明，其磷去除效能与生长代谢显著相关。许多研究表明，在有氧吸磷过程中，低pH值会抑制磷的吸收、PHA的利用和生物量的增长，表明较高的pH值更有利于PAOs的除磷效果^{[参考文献 23-24}23-24]。在pH值为7时，PK01和PK03的平均除磷率分别达到88.23%和75.69%，PK02的平均除磷率达到了82.45%，然而，当pH值为8时，PK02展示出了更好的磷去除效果，去除率达到了85.43%。同时，在pH值为6时PK01平均除磷率也达到了81.56%，说明PK01对pH值变化的适应性更强。

图3 pH值对3株细菌生长及除磷率的影响

Fig. 3 Effects of pH value on growth and phosphorus removal rate of three strains

2.3.2 温度对3株细菌生长及除磷率的影响

生物除磷系统受温度影响十分明显，之前有研究分析了夏季（26.7±1.4） ℃、秋季（19.7±2.0） ℃和冬季（16.4±0.7） ℃ EBPR系统生物除磷性能的变化，结果表明，随着温度降低，常规PAOs的丰度和系统磷去除性能显著提升^[

25]。然而，由图4可以看出，3株细菌在20~40 ℃的除磷率变化基本都呈现出正态分布的规律，在25 ℃时,PK01和PK03的除磷率达到最高,分别为89.4%和76.95%；在30 ℃时,PK02的除磷率达到最高（82.45%）。PK01和PK03的OD₆₀₀在20~40 ℃的变化范围较小，分别保持在1.355~1.553和1.293~1.040 7，表明在该温度变化范围内PK01和PK03可以稳定生长。PK02的生长受温度影响较大，OD₆₀₀在30 ℃达到最高（1.425），在20 ℃和40 ℃分别仅达到0.885 3和0.713，3株细菌除磷率与OD₆₀₀的相关系数R²分别达到0.895 2、0.979和0.801 7，表明温度影响3株细菌的生长代谢，从而改变了其除磷率。

图4 温度对3株细菌生长及除磷率的影响

Fig. 4 Effects of temperature on growth and phosphorus removal rate of three strains

2.3.3 碳源对3株细菌生长及除磷率的影响

碳是微生物生长代谢最重要的营养物质，不同类型的碳源组成成分及分解速率并不相同，从而影响聚磷菌的活性。利用乙酸钠、丙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠和葡萄糖考察不同碳源对3株细菌除磷率的影响。由图5可以看出，乙酸钠和丙酸钠都可以作为3株除磷细菌的优质碳源，3株菌的除磷率都达到了70%，甚至80%以上。琥珀酸钠只能被PK01和PK02有效利用，除磷率分别为84.21%和63.10%。以柠檬酸钠和葡萄糖作为碳源时，PK03也表现出较好的除磷率，分别达到了59.75%和77.13%。

图5 碳源对3株细菌生长及除磷率的影响

Fig. 5 Effects of carbon source on growth and phosphorus removal rate of three strains

2.4 菌株的磷转化途径

2.4.1 菌体、SMP及EPS的产量

通过好氧除磷试验测定分析了3株细菌的磷转化分布过程，图6显示了3株细菌的菌体干重、SMP和EPS浓度的变化。PK01的细菌干重在12 h达到6.05 mg后趋于平稳，PK03的积累速率较为缓慢，但在24 h后仍达到了6.73 mg，PK02表现出更高的积累量，在24 h达到了9.22 mg，说明PK02在同一环境下对外界基质的利用似乎更偏向于细胞合成。3株细菌SMP和EPS的产量变化表现出了相似的增长趋势，24 h时PK01、PK02和PK03的SMP分别达到了34.38、30.8、34.33 mg COD/L，EPS分别达到了81.15、128.84、88.67 mg COD/L。有研究表明，在碳源不足的条件下，EPS会部分水解转化为SMP，而在碳源充足的条件下EPS和SMP浓度持续升高并趋于稳定，且EPS浓度始终高于SMP^[

13, 26]。3株细菌EPS的产量自始至终要高于SMP，可能与培养基营养物充足有关。同时可以发现，PK02的干重和EPS产量要高于PK01和PK03，这也说明PK02将外界基质用于自身合成和代谢的效率要高于其他菌株，符合Klebsiella菌属共有的特征，其一直以生物膜形成能力而闻名^{[参考文献 27

百度学术}27]，且该菌属合成分泌EPS的特性与其糖类和蛋白质的高合成代谢相关^{[参考文献 28

百度学术}28]。

图6 3株细菌的菌体干重、SMP和EPS产量

Fig. 6 Biomass, SMP and EPS production of three strains

2.4.2 磷转化分布

通过测定菌体和环境中的总磷（TP）与无机磷（IP），将培养基中的磷分成培养基中溶解性无机磷（BS-IP）、培养基中溶解性有机磷即SMP中的有机磷（SMP-OP）、细菌胞内无机磷（IN-IP）、细菌胞内有机磷（IN-OP）、EPS中无机磷（EPS-IP）和EPS中有机磷（EPS-OP），24 h磷转化分布如图7~图9所示。在50 mL反应体系中，3株细菌的初始BS-IP分别为0.963 5、0.963 5、0.977 8 mg，分别占体系的98.94%、98.97%、98.49%。

图7 Acinetobacter sp. PK01的磷转化分布

Fig. 7 Phosphorus transformation and distribution of Acinetobacter sp. PK01

图8 Klebsiella sp. PK02的磷转化分布

Fig. 8 Phosphorus transformation and distribution of Klebsiella sp. PK02

图9 Enterobacter sp. PK03的磷转化分布

Fig. 9 Phosphorus transformation and distribution of Enterobacter sp. PK03

PK01的磷转化分布如图7所示，24 h后BS-IP总量降低到0.095 5 mg，SMP-OP总量达到了0.018 3 mg，培养基中的总磷大量减少，仅占整个反应体系的11.59%。IN-IP和IN-OP分别增长到0.539 7、0.145 8 mg，胞内无机磷和有机磷分别占整个反应体系的54.93%和14.84%，说明PK01将胞外无机磷吸收到胞内，一部分用于细胞合成代谢，大部分IP作为多聚磷酸盐存在于体内，一般菌体含磷量只有菌体干重的2%，而聚磷菌在增殖过程中可以大量吸收溶解态正磷酸盐，在胞内积累多聚磷酸盐，使磷积累达到细胞干重的6%~8%^[

29]，而PK01胞内总磷的质量占据细胞干重的11.33%，证明其具有更高效的聚磷能力。EPS-IP和EPS-OP分别增加到0.092、0.091 1 mg，仅占据了反应体系的9.37%和9.27%。

PK02的磷转化分布如图8所示，24 h后BS-IP总量降低到0.145 3 mg，SMP-OP总量达到了0.024 mg，培养基中的TP仅占据整个反应体系的17.16%，虽然基质中的无机磷大量降低，但PK02的胞内磷却远远低于PK01。其中，IN-IP和IN-OP分别达到了0.165 9、0.186 1 mg，占据整个反应体系的16.81%和18.86%，说明与PK01相比，PK02体内无法过量积累多聚磷酸盐，胞内TP的质量仅占据细胞干重的3.82%。EPS-IP和EPS-OP分别达到了0.292 9、0.172 6 mg，说明EPS对水体中IP的吸附作用去除了反应体系中29.68%的磷，EPS对水体TP的去除率为47.18%。近年来大量研究表明，EPS参与了生物除磷过程，明确了EPS具有一定的储磷功能，其不仅含有以细菌细胞分泌物或代谢产物形式存在的OP，同时也含有以高价阳离子沉淀物或络合物形式存在的IP^[

30]。而Klebsiella菌属EPS高产、高絮凝活性的特点有利于其对IP的吸附作用，因此，PK02的磷去除途径可能更多地依靠EPS的合成及其吸附作用。

PK03的磷转化分布如图9所示，24 h后BS-IP总量降低到0.136 5 mg，SMP-OP总量达到了0.101 4 mg，培养基中的TP占据整个反应体系的24.11%，基质中的IP残余量和PK02接近，但SMP中的OP超过了PK02的4倍，且SMP-OP的增长在12 h后尤为明显，说明在对数期生长过程中，即繁殖代谢最旺盛期间，PK03利用了大量的IP合成OP，如磷脂、核酸和活性酶等。而IN-IP和IN-OP分别达到了0.214 4、0.157 7 mg，占整个反应体系的21.73%和15.98%，胞内TP的质量占据了细胞干重的5.53%。EPS-IP和EPS-OP分别达到了0.114 3、0.262 3 mg，说明EPS对于环境中磷去除贡献了38.17%。

3 结论

1）从活性污泥中筛选出3株高效除磷细菌PK01、PK02和PK03，通过形态观察、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析进行物种鉴定，将3株细菌命名为Acinetobacter sp. PK01、Klebsiella sp. PK02和Enterobacter sp. PK03，登录号分别为OL519151、OL519152、OL519153。

2）Acinetobacter sp. PK01在pH值为6~9和温度为25~35 ℃时都表现出较好的除磷效果，在pH值为7、温度为25 ℃时除磷率达到了89.4%；Klebsiella sp. PK02和Enterobacter sp. PK03更偏向于在中性偏碱性环境下除磷，在pH值为8、温度为30 ℃时，Klebsiella sp. PK02除磷率达到了85.43%；Enterobacter sp. PK03更适应20~30 ℃的环境，在pH值为7且温度为25 ℃时，其除磷率达到了76.95%。3株细菌在乙酸钠和丙酸钠作碳源时都表现出较好的除磷率，Acinetobacter sp. PK01和Enterobacter sp. PK03分别以琥珀酸钠和葡萄糖为碳源时也表现出较好的除磷效果。

3）Acinetobacter sp. PK01对环境中磷的去除主要依靠吸收胞外无机磷存储于体内，24 h后IN-IP占环境总磷的54.93%；Klebsiella sp. PK02对环境中磷的去除主要依靠EPS合成和吸附作用，24 h后EPS-IP和EPS-OP占环境总磷的47.18%；Enterobacter sp. PK03的EPS-IP和EPS-OP共达到环境总磷的38.17%，而SMP-OP和IN-OP都高于前两种菌。

参考文献

邓荣森, 郎建, 王涛, 等. 城市污水生物除磷脱氮机理研究探讨[J]. 重庆建筑大学学报, 2002, 24(3): 106-111. [百度学术]

DENG R S, LANG J, WANG T, et al. A study on mechanism of biological denitrification and phosphorus removal for urban wastewater [J]. Journal of Chongqing Jianzhu University, 2002, 24(3): 106-111. (in Chinese) [百度学术]

FUHS G W, CHEN M. Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of wastewater [J]. Microbial Ecology, 1975, 2(2): 119-138. [百度学术]

王楠, 蔡曼莎, 李亚静, 等.运行条件对强化生物除磷颗粒污泥系统性能及微生物群落的影响[J].土木与环境工程学报（中英文）,2021,43(4):202-210. [百度学术]

WANG N, CAI M S, LI Y J, et al. Effect of operation conditions on the performance and microbial community of an enhanced biological phosphorus removal granular sludge system [J]. Journal of Civil and Environmental Engineering, 2021, 43(4): 202-210. (in Chinese) [百度学术]

汪昆平, 邓荣森, 李伟民, 等. 氧化沟脱氮除磷强化途径[J]. 重庆建筑大学学报, 2006, 28(6): 79-83. [百度学术]

WANG K P, DENG R S, LI W M, et al. Approach to the enhancement of removal of phosphorus and nitrogen in oxidation ditch [J]. Journal of Chongqing Jianzhu University, 2006, 28(6): 79-83. (in Chinese) [百度学术]

张园, 罗固源, 许晓毅, 等. UCT工艺进水COD浓度与C/N对除磷效果的影响[J]. 环境科学, 2010, 31(8): 1846-1850. [百度学术]

ZHANG Y, LUO G Y, XU X Y, et al. Effect of the influent COD and C/N ratio on phosphorus removal of UCT system [J]. Environmental Science, 2010, 31(8): 1846-1850. (in Chinese) [百度学术]

ALMOMANI F, BOHSALE R R. Optimizing nutrient removal of moving bed biofilm reactor process using response surface methodology [J]. Bioresource Technology, 2020, 305: 123059. [百度学术]

庄志刚, 韩永和, 章文贤, 等. 高效聚磷菌Alcaligenes sp.ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性[J]. 环境科学学报, 2014, 34(3): 678-687. [百度学术]

ZHUANG Z G, HAN Y H, ZHANG W X, et al. Isolation, identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp. strain ED-12 for phosphorus-accumulation [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2014, 34(3): 678-687. (in Chinese) [百度学术]

FAN Z W, ZENG W, WANG B G, et al. Transcriptional responses of Candidatus Accumulibacter clades to environmental dynamics in enhanced biological phosphorus removal [J]. Bioresource Technology, 2020, 306: 123108. [百度学术]

WU L W, NING D L, ZHANG B, et al. Global diversity and biogeography of bacterial communities in wastewater treatment plants [J]. Nature Microbiology, 2019, 4(7): 1183-1195. [百度学术]

吴云, 范丙全, 隋新华, 等. 适应菲胁迫的高效聚磷菌筛选及聚磷特性研究[J]. 环境科学, 2008, 29(11): 3172-3178. [百度学术]

WU Y, FAN B Q, SUI X H, et al. Screening of two phenanthrene-utilizing and high-effective phosphorus-accumulating bacteria and their effects on phosphorus-accumulating characteristics [J]. Environmental Science, 2008, 29(11): 3172-3178. (in Chinese) [百度学术]

张文艺, 陈晶, 邓文, 等. 反硝化聚磷菌菌剂种子液制备条件及除磷机理[J]. 土木建筑与环境工程, 2014, 36(6): 99-105. [百度学术]

ZHANG W Y, CHEN J, DENG W, et al. Preparation of denitrifying phosphorus accumulating bacterial seed liquid and analysis of phosphorus removal mechanism [J]. Journal of Civil, Architectural & Environmental Engineering, 2014, 36(6): 99-105. (in Chinese) [百度学术]

CLOSE K, MARQUES R, CARVALHO V C F, et al. The storage compounds associated with Tetrasphaera PAO metabolism and the relationship between diversity and P removal [J]. Water Research, 2021, 204: 117621. [百度学术]

REN T, CHI Y L, WANG Y, et al. Diversified metabolism makes novel Thauera strain highly competitive in low carbon wastewater treatment [J]. Water Research, 2021, 206: 117742. [百度学术]

张娟, 方祥位, 刘汉龙, 等. 石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性[J]. 土木与环境工程学报(中英文), 2020, 42(1): 144-152. [百度学术]

ZHANG J, FANG X W, LIU H L, et al. Isolation, identification and degradation characteristics of microorganisms in petroleum contaminated soil [J]. Journal of Civil and Environmental Engineering, 2020, 42(1): 144-152. (in Chinese) [百度学术]

陈亚松, 金文标, 闫韫, 等. 高效聚磷菌的筛选及其应用[J]. 净水技术, 2011, 30(2): 19-22. [百度学术]

CHEN Y S, JIN W B, YAN Y, et al. Screening and application of high efficient phosphate-accumulating organisms (PAOs) [J]. Water Purification Technology, 2011, 30(2): 19-22. (in Chinese) [百度学术]

马放, 杨菲菲, 李昂, 等. 1株高效反硝化聚磷菌的生物学特性研究[J]. 环境科学, 2011, 32(9): 2710-2715. [百度学术]

MA F, YANG F F, LI A, et al. Biological characteristics of denitrifying polyphosphate-accumulating organisms [J]. Environmental Science, 2011, 32(9): 2710-2715. (in Chinese) [百度学术]

蔡天明, 陈立伟, 吴守中, 等. 1株脱氮除磷菌的筛选及其特性研究[J]. 环境科学, 2010, 31(10): 2487-2492. [百度学术]

CAI T M, CHEN L W, WU S Z, et al. Selection of denitrifying phosphorus-removing bacteria and its characteristic [J]. Environmental Science, 2010, 31(10): 2487-2492. (in Chinese) [百度学术]

欧阳彤, 涂保华, 李乔, 等. 多级AO+潜流湿地对生活污水中的EDCs及常规污染物的去除试验研究[J]. 土木与环境工程学报(中英文), 2020, 42(3): 156-164. [百度学术]

OUYANG T, TU B H, LI Q, et al. Experimental study on the removal of EDCs and conventional pollutants indomestic sewage by multi-stage AO + subsurface flow constructed wetland [J]. Journal of Civil and Environmental Engineering, 2020, 42(3): 156-164. (in Chinese) [百度学术]

翟俊, 李岳. 微曝气强化人工湿地处理生活污水试验研究[J]. 土木与环境工程学报(中英文), 2020, 42(6): 178-184. [百度学术]

ZHAI J, LI Y. The effects of domestic wastewater treatment by micro-aerated hybrid constructed wetland [J]. Journal of Civil and Environmental Engineering, 2020, 42(6): 178-184. (in Chinese) [百度学术]

ZHOU Y, NGUYEN B T, ZHOU C, et al. The distribution of phosphorus and its transformations during batch growth of Synechocystis [J]. Water Research, 2017, 122: 355-362. [百度学术]

RODGERS M, WU G X. Production of polyhydroxybutyrate by activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal [J]. Bioresource Technology, 2010, 101(3): 1049-1053. [百度学术]

LI H K, ZHONG Y M, HUANG H, et al. Simultaneous nitrogen and phosphorus removal by interactions between phosphate accumulating organisms (PAOs) and denitrifying phosphate accumulating organisms (DPAOs) in a sequencing batch reactor [J]. The Science of the Total Environment, 2020, 744: 140852. [百度学术]

WANG D B, ZHENG W, LIAO D X, et al. Effect of initial pH control on biological phosphorus removal induced by the aerobic/extended-idle regime [J]. Chemosphere, 2013, 90(8): 2279-2287. [百度学术]

ZHANG T, LIU Y, FANG H H P. Effect of pH change on the performance and microbial community of enhanced biological phosphate removal process [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2005, 92(2): 173-182. [百度学术]

YUAN C S, WANG B, PENG Y Z, et al. Simultaneous enhanced biological phosphorus removal and semi-nitritation (EBPR-SN) followed by anammox process treating municipal wastewater at seasonal temperatures: From summer to winter [J]. Science of the Total Environment, 2021, 757: 144048. [百度学术]

LASPIDOU C S, RITTMANN B E. A unified theory for extracellular polymeric substances, soluble microbial products, and active and inert biomass [J]. Water Research, 2002, 36(11): 2711-2720. [百度学术]

DIXON M, FLINT S, PALMER J, et al. Analysis of culturable and non-culturable bacteria and their potential to form biofilms in a primary treated dairy wastewater system [J]. Environmental Technology, 2018, 39(17): 2185-2192. [百度学术]

YANG J X, WEI W, PI S S, et al. Competitive adsorption of heavy metals by extracellular polymeric substances extracted from Klebsiella sp. J1 [J]. Bioresource Technology, 2015, 196: 533-539. [百度学术]

李雅婷. 氮磷同化海洋菌-藻共生系统的建立及其在含盐污水处理中的研究[D]. 济南: 山东大学, 2018. [百度学术]

LI Y T. Establishment of nitrogen-phosphorus assimilation marine bacterial-algal mutualistic system and its application in saline sewage treatment [D]. Jinan: Shandong University, 2018. (in Chinese) [百度学术]

ZHANG H L, FANG W, WANG Y P, et al. Phosphorus removal in an enhanced biological phosphorus removal process: Roles of extracellular polymeric substances [J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(20): 11482-11489. [百度学术]