内分泌干扰物(EDCs)，也称为环境激素，是能进入生物体内对生物内分泌系统、生殖系统及免疫系统造成危害的新型环境污染物。随着城镇化和工业化的进行，环境中EDCs的污染正在不断加重，一定含量(ng/L水平)的EDCs会扰乱机体正常代谢，类固醇类环境雌激素则是生活污水中危害较大、较为典型的环境内分泌干扰物。Cappiello等[1]研究发现，不少猝死的婴儿体内残留的EDCs含量相对普通新生婴儿较多，Moreira等[2]则通过小鼠实验发现，当小鼠体内E2、EE2的含量偏高时，易对其生殖免疫系统产生不同程度的损害，由此可见，当类固醇类激素通过水循环等生态途径传入食物链，最终被人体所蓄积，随着激素量的增长，从而对人体健康产生一定的威胁。
据资料统计，中国众多污水处理厂出水和河流都检出不同的EDCs含量[3-5]。目前，针对环境中EDCs的去除主要集中在污水处理工艺、物理吸附等[6]，如污水厂中的混凝、活性炭吸附、活性污泥法和膜生物反应器等，应用生物-生态耦合处理的研究较少。陈栋等[7]研究指出混凝对大多数EDCs去除效果较差，活性炭吸附仅对E1的去除率可达60%以上，对E2和EE2的去除仅为43%。阳春等[8]研究指出，一级处理污水厂对雌激素的去除率为33%，二级生物处理污水厂对雌激素的去除率为59%~94%，所以，使用现有污水厂的生物处理工艺去除雌激素，可能未能将其浓度降低到环境影响值以下。而人工湿地作为一种去除EDCs的新型研究对象，正引起人们的广泛重视，杨可昀等[9]研究指出，对人工湿地植物根系调控可使雌激素的去除率高达70%以上。所以，在生物单元的基础上，用生态技术进一步处理污水，对去除水体中的EDCs具有重要意义。
笔者选择生活污水中常见的4种类固醇类内分泌干扰物作为考察对象，分别为天然雌激素雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和人工合成的用于口服避孕药使用的17α-乙炔基雌二醇(EE2)，并采用无硝化液内回流多级AO+潜流式人工湿地处理含一定浓度雌激素的农村生活污水，考察组合工艺的去除效果，并分析加药前后系统内微生物群落结构变化。
试验装置由集水池、无硝化液内回流多级AO、垂直潜流式人工湿地组成，工艺流程图如图 1所示。无内回流多级AO反应器有效容积依次为2.6、3.9、2.6、3.9 L，缺氧区和好氧区的容积比约为2:3，采用下端进水，上端出水，高低落差自流式处理方式，并向缺氧区和好氧区投加一定的活性污泥和生物填料，缺氧区和好氧区利用活性污泥和悬浮生物填料上微生物协同作用降解污染物，达到脱氮除磷的目的。好氧区使用黏砂曝气头曝气，试验进水、污泥回流采用蠕动泵进行控制。
人工湿地由配水槽、湿地处理区和出水收集区组成，长宽高为1、0.6、0.65 m。湿地基质从下到上由不同粒径、不同厚度的砾石、红砖碎块、钢渣、陶粒和土壤构成，其粒径分别为40~50 mm、20~40 mm、8~10 mm、4~8 mm，其铺设厚度分别为10、25、10、10、10 cm，湿地孔隙率为41.6%。基质填充后，于土壤层后移植茭白、梭鱼草、黑麦草等植物。在组合工艺运行前使人工湿地单独运行1个月，让移植植物适应人工湿地系统环境，健康成长，并完成湿地床的挂膜。
试验原水为常州某地生活污水，水质见表 1。
试验进水在该生活污水的基础上添加雌酮(E1)、雌二醇(E2)、乙炔基雌二醇(EE2)和雌激素三醇(E3)4种EDCs，浓度在35~55 μg/L之间。
试验在前端无回流多级AO的HRT为4、7、7.5、9.5、12.5 h下进行，多级AO出水由水泵提入人工湿地中，流量与进水一致，待装置稳定运行后对各反应器进出水进行水质指标检测，由试验结果得出最佳水力停留时间，在此条件下，运行装置用以去除类固醇类内分泌干扰物。
试验所需主要仪器为：ZGDCY-24S型水浴氮吹仪(上海梓桂仪器有限公司，中国)，DG12D型固相萃取仪，SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵(南京科尔仪器设备有限公司，中国)，Trace ISQLT型气相色谱-质谱仪(赛默飞科技有限公司，美国)。
所用主要化学试剂：E1、E2、E3和EE2标准品(纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，BSTFA(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，吡啶(分析纯，永华化学科技有限公司)，二氯甲烷(分析纯，永华化学科技有限公司)，丙酮(分析纯，国药化学试剂有限公司)，甲醇(HPLC级，国药化学试剂有限公司)，正己烷(分析纯，江苏强盛功能化学有限公司)。
取1 L的水样，采用0.45 μm的GF/F滤膜抽滤，用硫酸将滤液pH调到3以下。
Simon Acti-Carb SPE固相萃取柱依次用2.5 mL甲醇、3.5 mL超纯水分别活化3次。取抽滤完的1 L水样，以10 mL/min速率过固相萃取柱，再分别加入8 mL甲醇、8 mL二氯甲烷、8 mL正己烷进行洗柱，最后用10 mL的二氯甲烷和丙酮的混合溶液淋洗小柱，收集淋洗液。
将淋洗液在35~40 ℃的水浴氮吹仪中用高纯度氮气缓慢浓缩至1 mL，取100 μL浓缩液至色谱进样瓶中，再由氮气吹干，然后加入25 μL BSTFA和50 μL吡啶，于常温条件下反应20 min，进行GC-MS分析。
气质联用仪色谱柱为TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，气相条件如下。
GC：以氦气为载气，流速1 mL/min；不分流方式进样，进样口温度280 ℃，进样体积1 μL；柱初始温度为50 ℃，保持2 min，以12 ℃/min程序升温至260 ℃，保持8 min，再以3 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min。
MS：接口温度280 ℃，传输线温度300 ℃，离子源为EI源，温度250 ℃，电子轰击能量70 eV，溶剂延迟时间12 min，以全扫描模式定性，扫描范围参数m/z为50~600，以选择离子扫描模式定量。
根据其衍生产物的特征碎片离子分布特征从而来确定目标产物的实际浓度，衍生产物的实际参数见表 2。
图 2为所测的E1、E2、EE2、E3衍生产物的总离子特征分布图。
采集投加EDCs后运行2个月以内的好氧池污泥，冷冻保存，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行454焦磷酸测序测定，并与之前测定的未加任何内分泌干扰物和菌剂的污泥进行对比。
随着HRT的增加，前端无回流多级AO对CODCr的去除率呈轻微上升趋势。HRT对CODCr的去除效果影响不大。由图 3可知，试验期间，无回流多级AO装置平均进水浓度为220.02 mg/L，出水平均浓度为58.03 mg/L。CODCr的去除主要靠无回流多级AO中的悬浮性活性污泥和生物膜上的好氧、兼氧、厌氧生物菌群的新陈代谢来去除。多级AO出水进入潜流式人工湿地继续处理，其出水在5种水力停留时间下都较好，无明显差别，说明人工湿地对CODCr去除率受HRT影响较小，这与梁康等[10]的结论相似，5种HRT下的去除率都约在80%左右，CODCr的平均出水浓度为31.64 mg/L。
由图 4可知，随着HRT的增加，无回流多级AO对氨氮的去除率逐渐上升，去除率由59.32%增加到96.25%，HRT对NH4+-N的去除效果影响较大，这与潘欣语等[11]的结论类似，在水力停留时间为9.5 h时，去除效果与张国珍等[12]研究的水力停留时间为10 h时，三级缺氧-好氧对NH4+-N的去除效果相近。HRT越长，两段好氧池的硝化作用使硝化细菌对NH4+-N的转化越充分，湿地植物根系释放氧气，形成根区与非根区的好氧、厌氧环境，强化硝化与反硝化作用，加快NH4+-N去除。整个试验运行期间，NH4+-N平均进水浓度为26.46 mg/L，平均出水浓度为0.86 mg/L，平均去除率为96.76%。
由图 5可知，HRT由4 h增加到7 h时，无回流多级AO对TN的去除效率由52.07%提高到65%；当HRT继续延长至12.5 h，去除率平稳上升，从65%上升至77.27%。污水进入湿地后，HRT对湿地去除TN的影响不大，出水平均浓度为3.94 mg/L，平均去除率为87.36%，去除效果较好。冷璐等[13]和Baek等[14]研究表明，在低溶解氧下会发生同步硝化反硝化，与传统硝化反硝化相比，同步硝化反硝化可节省约1/4的能耗和2/5的碳源。而试验中缺氧池的溶解氧控制在0.2~0.6 mg/L之间，加上好氧池污水带来部分溶解氧，便形成了好氧、缺氧、厌氧3个梯度的区域生存环境，从而在系统内形成了既有利于硝化菌和反硝化菌的生存环境，也有利于异养硝化反硝化菌的同步硝化反硝化作用的发生，而对缺氧池、好氧池的高通量测序中，均发现了异养硝化反硝化的菌属。此外，投加丝状填料和悬浮填料可形成泥-膜共生处理系统，提高系统中的微生物量[15]，强化去除效果。污水进入湿地后，通过湿地微生物硝化反硝化作用，植物对氮素的吸收，使得TN被进一步去除。
据Liu等[16]和尹子华等[17]研究表明，多级AO可同步实现脱氮除磷的作用，污水在在系统中反复进行2次或2次以上的厌氧放磷和好氧吸磷，对磷的去除效率可达到60%以上。由图 6可知，随着HRT的增大，无回流多级AO对TP的去除率逐渐上升，去除率分别为46.2%、58.9%、62.32%、67.54%和69.77%，但由于进水COD不高，有限的碳源优先被用来反硝化脱氮，剩余碳源有限，故除磷效果受到限制，这与陈杰云等[18]的结论类似。人工湿地对不同HRT下的尾水都保持了较好的TP去除效果，随着HRT的增加，TP去除效率呈上升趋势。综上分析认为，当多级AO、湿地HRT分别为9.5 h、10.3 d左右时，处理效果较好，CODCr、NH4+-N、TN和TP平均去除率分别为78.64%、97.16%、91.84%、90.55%，满足了太湖流域污水的高标准《太湖地区城镇污水处理厂及重点工业行业主要水污染物排放限值》(DB 32/1072—2017)排放要求，继续延长水力停留时间，去除效果虽然小有提升，但考虑到运行成本、操作方便等因素，以多级AO HRT为9.5 h、湿地HRT为10.3 d为组合工艺的最佳水力停留时间。
在整个试验检测周期中，多级AO+潜流式人工湿地保持连续进水，且进出水水质稳定，其对4种雌激素的去除效果如图 7所示。由图 7可以看出，在E1进水浓度为52.24 μg/L的情况下，系统出水浓度为2.07 μg/L；E2进水浓度为45.79 μg/L，出水浓度为3.46 μg/L；E3进水浓度为43.82 μg/L，出水浓度为6.53 μg/L；EE2进水浓度为39.76 μg/L，出水浓度为4.62 μg/L。多级AO+潜流式人工湿地组合工艺对E1、E2、E3和EE2这4种雌激素去除率分别达96.04%、92.45%、85.09%、88.38%，去除效率较好，都在80%以上，相比传统活性污泥工艺，其在组合工艺中的出水浓度更低。其中，对E1的去除效率最高，E2次之，EE2再次之，E3最低。E3在组合工艺中的去除率偏低，可能是因为E3生物活性最弱，稳定性强，E3是E1和E2生物降解过程中的中间产物，E1和E2降解的同时，一部分转化为E3所致[19]。
由图 8可以看出，多级AO对4种雌激素E1、E2、E3和EE2的去除率分别达到75.50%、72.00%、65.08%和63.35%，各生物单元对EDCs的降解都起到了一定的作用，表明污泥吸附对EDCs有较强的去除效果，这是由于类固醇类EDCs多半有亲脂疏水的特性。组合工艺各反应器对雌激素的去除贡献率由大到小依次为一级好氧池、人工湿地、一级厌氧池、二级缺氧池和二级好氧池。多级AO系统中，E1、E2和E3雌激素的去除主要依靠厌氧池、好氧池、缺氧池。而EE2在厌氧池中去除率较低，这与雌激素在活性污泥中的吸附亲和力有关，Andersen等[20]指出，E1、E2和EE2在污泥上的吸附亲和力依次增大。一级好氧池和二级缺氧池对4种雌激素的去除贡献较大，其中，一级好氧池对污染物的去除可达27%以上，表明污泥吸附后的生物降解进一步去除了雌激素，且池中存在的好氧或兼性厌氧菌对EDCs的去除起着重要作用，陈栋等[21]指出异养菌的好氧分解和硝化菌的硝化作用可以一定程度上有效地降解EDCs浓度，并且厌氧-好氧的运行模式可培育出良好的脱氮除磷菌群结构，这种特性的污泥对雌激素的吸附效果可能更好。污水进入湿地后，系统对E1、E2、E3的去除率约为20%，EE2为25%，表明潜流式湿地可进一步去除EDCs。潜流式湿地对EDCs去除可能是湿地基质吸附、湿地植物吸收和湿地微生物降解菌的降解三者共同作用。而湿地种植根系发达的茭白等植物，这些植物根系泌养和根系微生物对雌激素的去除所起的促进作用可能更大[22]。
Alpha多样性指数[23]常被用来反映微生物群落生态中的物种丰富度和多样性。其中，Chao1指数和ACE指数的数值越大，则表明样品的物种数量越多；Shannon指数和Simpson指数是用来反映微生物群落多样性的指数，Shannon指数越高则表明群落多样性越高，而Simpson指数则恰好相反[24]。表 3反映的是好氧池投EDCs前后Chao1、ACE、Shannon、Simpson和OTU等值的变化情况。从表 3可以看出，投加雌激素后的Chao1、ACE值要远大于投加前的，表明加雌激素后的物种数量要多于未加前，而Shannon指数值则相差无几，Simpson指数值是投加雌激素前略大于投加后，表明投加雌激素后的好氧池微生物群落多样性要大于投加前。
加雌激素运行35 d后的好氧池微生物群落结构(门水平)如图 9(a)所示，与未加EDCs相比(如图 9(b)所示)，投加后的好氧池微生物群落门水平发生变化，相对丰度＞1%的仅有4类菌门，分别为Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)和Chloroflexi(绿弯菌门)，而未加药的有10类菌门。其中，变形菌门丰度较之前增加了近13%，厚壁菌门增加了近15.6%，绿弯菌门减少了近14%。加雌激素运行35 d后的好氧池微生物群落结构(属水平)如图 10(a)所示，与未投药相比(如图 10(b)所示)，群落结构属水平发生变化，相对丰度＞1%的菌种由原来的9类增加到16类，且菌属类型也发生变化。其中，变化最大的是Acinetobacter(不动杆菌属)，增加了9.16%，成为绝对优势菌属。Hydrogenophaga(氢噬胞菌属)增加了1.6%，Pseudomonas(假单胞菌属)由0.05%增至0.45%，此外，还出现Comamonas(丛毛单胞菌，3.3%)、Proteocatella(1.4%)、Brevundimonas(短波单胞菌属，5.0%)等优势菌属。
McAdam等[25]研究碳化、硝化、硝化反硝化3种活性污泥对雌激素的去除效率，去除效率由高到低分别是硝化活性污泥(91%)、硝化反硝化活性污泥(80%)、碳化活性污泥(51%)，进一步证实了异养菌对EDCs的去除有显著的强化作用。不动杆菌属、假单胞菌属都具有硝化反硝化作用，此类微生物不仅能完成有机氮和无机氮的硝化过程及代谢难降解的有机物，且均可在缺氧或好氧条件下将亚硝酸根离子或硝酸根离子还原为氮气，而丛毛单胞菌可以进行短程硝化反硝化作用，这表明投加EDCs后增加的不动杆菌属、假单胞菌属和丛毛单胞菌等脱氮优势菌属对系统中雌激素的去除起到了促进作用。
1) 当多级AO HRT为9.5 h、湿地HRT为10.3 d时，组合工艺对CODCr、NH4+-N、TN和TP污染物去除率可分别达78.64%、97.16%、91.84%、90.55%，满足了太湖流域污水的高标准排放要求。无回流多级AO+潜流式人工湿地组合工艺对E1、E2、E3和EE2这4种EDCs有较高的去除效果，去除率分别达96.04%、92.45%、85.09%、88.38%，其中，E1去除效果最好，而E3去除率偏低，可能是因为E3是E1和E2生物降解过程中的中间产物。
2) EDCs的去除主要依靠活性污泥吸附与微生物降解。生物单元多级AO中，一级好氧池和二级缺氧池对4种雌激素的去除贡献较大，表明好氧或兼性厌氧菌对EDCs的去除起着重要作用。生态单元中，湿地基质的吸附、湿地植物发达根系泌养和根系微生物对于4种EDCs的去除效率可在生物单元基础上提高20%~25%。
3) Alpha多样性指数分析表明，加入EDCs后运行的好氧池物种数量和多样性要多于未加前，门分类和属分类的微生物群落物种及其丰度分析表明，变形菌门丰度较之前增加了近13%，厚壁菌门增加了近15.6%，增加的反硝化菌属Acinetobacter、Comamonas和Pseudomonas等成为优势菌属，对系统中雌激素的去除起到了促进作用。
2020, Vol. 42 Issue (3): 156-164 doi: 10.11835/j.issn.2096-6717.2020.003 
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2020, Vol. 42 Issue (3): 156-164 doi: 10.11835/j.issn.2096-6717.2020.003 PDF