由于胞外聚合物、细胞膜和细胞壁的存在，剩余污泥中的有机物不易被释放，通常以固相形式存在于细胞内，因此，常认为有机物的溶解是污泥发酵过程的第一步。而在污泥中投加亚硝酸盐可破坏剩余污泥紧密的团聚结构、使细胞破壁，促进细胞内有机物的释放、增溶和水解(图 2(a))，在投加亚硝酸盐后剩余污泥团聚体由紧密变为破碎，表面出现孔洞结构，同时，细胞表面出现破裂和溶解。

图 2

图 2 第6天两反应器内污泥样品的物理化学表征分析 Fig. 2 The physiochemical characterization of sludge samples

两组反应器中剩余污泥在6 d的产酸阶段中溶解性有机物含量的变化如图 3所示，由于此阶段并没有投加引种污泥，因此，溶解性有机物含量的增加均来自剩余污泥本身。如图 3所示，经过6 d的发酵，R2中添加亚硝酸盐有利于污泥的SCOD、溶解性蛋白和溶解性多糖的溶解。第5天R2的SCOD浓度达到峰值4 158.33 mg/L，比空白反应器提高近4倍，可见，亚硝酸盐可以增强污泥中有机物溶解的能力，与Lu等^{[8, 18]}的结果一致。同时，亚硝酸盐的投加能够提高污泥破壁水解的速率，如第一天R2组SCOD达到1 968.92 mg/L，净增加量是R1的1.82倍。

图 3

图 3 0~6 d两组反应器内有机物含量的变化 Fig. 3 Change in the organic matter concentration during the initial 6-day experiments

蛋白和多糖是污泥EPS和细胞壁的主要组成成分，也是使有机物难以被释放的关键原因^[19]。如图 3(d)，经过6 d的发酵阶段后，所有反应器中总蛋白和总多糖的含量均有不同程度的减少，R1和R2中总蛋白的浓度(COD)由612.7 mg/L分别减少至503.8、456.3 mg/L。同时，相对于R1，R2中溶解性蛋白和溶解性多糖的溶出量显著提高，分别达到85.79、366.51 mg/L，在总蛋白和总多糖中的比重提高了16.83%和11.75%。

同时，R2组中有机氮化合物(如蛋白质)的水解过程也被促进。如图 4，第6天两组反应器中溶解性NH₄⁺-N的含量分别增加至40.45、61.14 mg/L，其产生速率在R2组中明显高于空白组。依据Wu等^[20]的研究，仅在高Fe(Ⅱ)/NO₂^-的摩尔比(大于50∶1)条件下，亚硝酸盐才会被完全还原为NH₄⁺，而低摩尔比则易产生气体产物，如N₂等。在R2组中添加亚硝酸盐后，Fe(Ⅱ)/NO₂^-摩尔比仅为2.63，远小于50∶1，可见R2组中持续增加的溶解性氨氮含量是含氮有机物水解速率提高的结果。

图 4

图 4 0~6 d两组反应器内NH4+含量的变化 Fig. 4 Change of NH4+ concentration during the initial 6-day experiments

采用三维荧光光谱法对反应器R1与R2内污泥发酵液中的溶解性有机物进行分析。依据Chen等^[17]的研究，根据可溶性有机物的激发波长(E_x)-发射波长(E_m)可以将三维光谱分为5个区域：区域Ⅰ(E_x<250 nm/E_m<330 nm)对应酪氨酸类物质；区域Ⅱ(E_x: 200~250 nm/E_m: 330~380 nm)对应色氨酸类物质；区域Ⅲ(E_x: 200~250 nm/E_m: 380~500 nm)对应富里酸类物质；区域Ⅳ(E_x: 250~400 nm/E_m: 200~380 nm)代表微生物副产物物质和蛋白质类物质，区域Ⅴ(E_x: 250~400 nm/E_m: 380~500 nm)代表腐殖质物质。亚硝酸盐投加后，R2中部分区域的荧光强度显著增强，包括Ⅰ区色氨酸、Ⅱ区酪氨酸和Ⅳ区微生物代谢产物，代表亚硝酸盐加入后促进了这几种物质在污泥样品中的溶出。一般认为Ⅱ区和Ⅴ区是微生物可利用区^[21]，如图 2(b)，R2组在Ⅱ区和Ⅳ区的荧光区域体积积分占比P_Ⅱ，n和P_Ⅳ，n总和为39.24%，大于R1中的27.70%，说明R2组的可生物降解性得到提高。另外，R2中V区腐殖酸的P_V，n也得到提高，腐殖酸类物质由于其富含醌基，可以作为电子穿梭体加强在Fe(Ⅲ)还原和有机物氧化过程中的电子传递。

图 5表示不同组中VFAs的成分构成和浓度，添加亚硝酸后，R2中VFAs被明显积累且显著高于空白组。如图 5(b)，在第6天R2组的VFA浓度达到1 127.19 mg COD/L，是R1组的3.7倍，这表明R2组污泥酸化率得到提高。在第5~6天，即使亚硝酸盐几乎被完全消耗，R2体系内VFAs仍在不断积累，这可能是其他复杂有机物向简单有机物的转化过程仍在被促进，表明除亚硝酸盐外，Fe(Ⅲ)还原过程能持续促进复杂有机物的水解和酸化。

图 5

图 5 0~6 d两反应器内VFAs浓度与成分组成 Fig. 5 The concentration and ratio of VFAs in each reactor during the initial 6-day experiments

采用高通量16S rRNA测序技术进行微生物群落结构分析，探究微生物对污泥水解、酸化过程的影响。表 1中列出属水平的细菌群落并进行相对丰度(定义占比低于0.05%的菌株归类于其他微生物(others)分析。第Ⅰ阶段，R1反应器中无明显的优势菌种，而添加亚硝酸盐后R2反硝化细菌相对丰度显著增加，约为R1的3.23倍(见表 2)，其中不动杆菌属(Acinetobacter)^[22]占据了主导地位，相对丰度达到27.95%。厌氧氨氧化菌的硝化单胞菌属(Nitrosomonas)^[23]及氨氧化共生细菌Armatimonadetes_gp5^[24]分别提高0.1%和0.32%，亚硝酸盐氧化细菌相对丰度也得到提高，包括假单胞菌属(Pseudomonas)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium) 相对丰度分别提高了3.08%、0.2%、0.03%、0.02%^[25]，可见，亚硝酸盐添加后提高了具有亚硝酸盐氧化的相关功能基因的微生物的优势。另外，NO₂^-反硝化产生了碱度，碱性发酵优势细菌Proteocatella^[26]逐渐取代其他不能适应的微生物，丰度达到9.31%。同时，因亚硝酸盐使污泥体系氧化还原电位降低，专性厌氧菌如梭菌属(clostridum)、厌氧绳菌(Anaerolinea)受到抑制，其丰度分别降低1.18%和6.06%。

表 1

表 1 两反应器内细菌群落 Table 1 Bacterial genus communities in each reactor 属名 相对丰度/% 属名 相对丰度/% R1 R2 R1 R2 Acinetobacter 5.56 27.95 Rhodobacteraceae 0.23 0.19 Proteocatella 0.27 9.31 Nitrosomonas 0.05 0.15 Pseudomonas 0.21 3.29 Alkaliphilus 0.04 0.11 Acetoanaerobium 0.33 2.55 Acidovorax 0.96 0.09 Saccharibacteria_ genera_incertae_sedis 1.12 2.13 Candidatus_ Hydrogenedens 0.07 0.08 Macellibacteroides 0.09 1.64 Bacteroides 0.03 0.08 Romboutsia 0.38 1.46 Thauera 0.18 0.07 Clostridium 2.47 1.29 Bacillus 0.04 0.07 Armatimonadetes_gp5 0.71 1.03 Anaerobacter 0.03 0.06 Thermomonas 1.61 0.74 Bdellovibrio 0.03 0.05 Anaerolinea 6.97 0.61 Longilinea 2.00 0.05 Bradyrhizobium 0.34 0.54 Tissierella 0.04 0.05 Petrimonas 0.08 0.52 Moraxellaceae 0.01 0.05 Sedimentibacter 0.01 0.47 Gp6 0.54 0.03 Proteiniclasticum 0.90 0.47 Flavobacterium 0.06 0.03 Dechloromonas 0.29 0.40 Ruminococcaceae 0.10 0.01 Hyphomicrobium 0.42 0.40 Microbacterium 0.18 0.20 Escherichia_Shigella 0.05 0.33 unclassified 57.73 34.16 Dokdonella 1.45 0.27 others 14.42 9.07

表 1 两反应器内细菌群落 Table 1 Bacterial genus communities in each reactor

表 2

表 2 两反应器内反硝化菌和铁还原菌相对丰度 Table 2 Relative abundances of denitrifiers and IRB 反硝化菌 相对丰度/% 铁还原菌 相对丰度/% R1 R2 R1 R2 Acinetobacter 5.56 27.95 Pseudomonas 0.21 3.29 Pseudomonas 0.21 3.29 Bacteroides 0.12 1.73 Bradyrhizobium 0.34 0.54 Escherichia 0.05 0.33 Microbacterium 0.18 0.20 Alkaliphilus 0.04 0.11 Anaerobacter 0.03 0.06 Desulfobulbus 0.06 0.07 Bacillus 0.04 0.07 Bacillus 0.04 0.07 Clostridium 2.47 1.29 Clostridium 2.47 1.29 Hyphomicrobium 0.42 0.40 other IRBs 0.06 0.06 Acidovorax 0.96 0.09 Thauera 0.18 0.07 other denitrifiers 0.17 0.12 Total 10.56 34.08 Total 3.05 6.95

表 2 两反应器内反硝化菌和铁还原菌相对丰度 Table 2 Relative abundances of denitrifiers and IRB

在R2中检测到多种可进行异化铁还原的细菌，包括假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、大肠杆菌(Escherichia_Shigella)、芽孢杆菌(Bacillus)、拟杆菌(Bacteroides)等，其相对丰度的总和约为空白组的2倍，其中兼性厌氧菌假单胞菌属(Pseudomonas)^[27]相对丰度达到3.29%，约为R1组的15.7倍，它可以参与异养反硝化，同时还原Fe(Ⅲ)，也可参与芳香烃及其他有机物的降解并代谢产生乙酸、丁酸、氨氮、二氧化碳等。泰氏菌(Tissierella)和Alkaliphilus也能参与芳香烃的降解，其丰度相对于R1分别提高了0.01%和0.07%。总的来说，R2组中投加亚硝酸盐带来较高的Fe(Ⅲ)浓度，使反硝化菌和铁还原菌丰度提升23.52%和3.9%，同时，发酵和水解功能使微生物得到富集。

2.2 投加亚硝酸盐对污泥厌氧消化的影响
跳转到：本文顶部跳转到：本文顶部　1 材料和方法　    1.1 引种污泥和剩余污泥　    1.2 实验设置　    1.3 分析指标和方法　2 结果与讨论　    2.1 投加亚硝酸盐对Fe和污泥水解的影响　        2.1.1 剩余污泥中铁的氧化和还原　        2.1.2 剩余污泥破壁和有机物增溶　    2.2 投加亚硝酸盐对污泥厌氧消化的影响　        2.2.1 对污泥减量和脱氮的影响　        2.2.2 投加亚硝酸盐的经济性分析　    2.3 亚硝酸盐促进剩余污泥水解的新原理　3 3结论　参考文献

2.2.1 对污泥减量和脱氮的影响
跳转到：本文顶部跳转到：本文顶部　1 材料和方法　    1.1 引种污泥和剩余污泥　    1.2 实验设置　    1.3 分析指标和方法　2 结果与讨论　    2.1 投加亚硝酸盐对Fe和污泥水解的影响　        2.1.1 剩余污泥中铁的氧化和还原　        2.1.2 剩余污泥破壁和有机物增溶　    2.2 投加亚硝酸盐对污泥厌氧消化的影响　        2.2.1 对污泥减量和脱氮的影响　        2.2.2 投加亚硝酸盐的经济性分析　    2.3 亚硝酸盐促进剩余污泥水解的新原理　3 3结论　参考文献

两个组在厌氧消化阶段Ⅱ结束后污泥减量化的结果如图 6(a)所示。依据Switzenbaum等^[28]提出的质量平衡公式计算发现，在第1阶段R2的VSS去除率仅为1.48%，但在厌氧消化后，R2组的TCOD、TSS、VSS的减量率分别达到40.92%、25.88%、36.66%, 比R1分别提高了6.06%、12.36%和15.69%。阶段Ⅱ结束时两组反应器的甲烷累积产量如图 6(b)所示，投加亚硝酸盐的R2组甲烷累积产量约为R1组的1.86倍。在前10天，R2组甲烷生产被显著抑制，而在第20天左右开始显著提高。空白组前6天就完成了2/3的甲烷生产，即使在阶段Ⅱ投加了新的引种污泥，其甲烷累积过程并未被显著促进，这是由于微生物细胞壁限制了固相污泥中有机物的释放，使其难以被水解酸化菌和产甲烷菌利用。综合甲烷产生量与TCOD、TSS和VSS的减量数据可以得出，投加亚硝酸盐后，污泥水解过程得到有效促进，为产甲烷菌提供了更多可溶性小分子底物，从而在整体过程中使污泥减量化率提高20.97%。

图 6

图 6 TCOD、TSS、VSS的减量化与甲烷累积产量 Fig. 6 The TCOD、TSS、VSS degradations and cumulative methane production during two groups

表 3对比了消化前后各组总氮变化情况。经过50 d的厌氧消化后，空白组R1和实验组R2的总氮含量由初始的1 144.79 mg/L分别变为1 065.93、953.46 mg/L，这表明添加亚硝酸盐虽增加了系统中的氮素投入，却不会增加额外的总氮污染，可能的原因是：1)投加的NO₂^--N大部分以N₂等气体形式损失；2)蛋白质等含氮有机物的加速降解造成总氮损失。

表 3

表 3 两反应器中总氮变化 Table 3 Change of TN concentration in each reactor 反应器 初始TN含量/ (mg·L-1) NO2--N投加量/(mg·L-1) 消化后TN含量/ (mg·L-1) R1 1 144.79 0 1 065.93 R2 1 144.79 243.48 953.46

表 3 两反应器中总氮变化 Table 3 Change of TN concentration in each reactor

2.2.2 投加亚硝酸盐的经济性分析
跳转到：本文顶部跳转到：本文顶部　1 材料和方法　    1.1 引种污泥和剩余污泥　    1.2 实验设置　    1.3 分析指标和方法　2 结果与讨论　    2.1 投加亚硝酸盐对Fe和污泥水解的影响　        2.1.1 剩余污泥中铁的氧化和还原　        2.1.2 剩余污泥破壁和有机物增溶　    2.2 投加亚硝酸盐对污泥厌氧消化的影响　        2.2.1 对污泥减量和脱氮的影响　        2.2.2 投加亚硝酸盐的经济性分析　    2.3 亚硝酸盐促进剩余污泥水解的新原理　3 3结论　参考文献

理论上1 mol亚硝酸盐可提供3 mol Fe(Ⅲ)氧化所需电子。以投加亚硝酸钠为例，如需代替投加1 g/L的氢氧化铁，亚硝酸钠投加质量浓度为0.207 g/L即可。经调研，工业级亚硝酸钠约3.5~5.6元/kg，工业级氢氧化铁约10~15元/kg。因此，投加亚硝酸盐试剂的成本仅为三价铁盐的4.8%~11.6%。另外，许多学者考虑在工程应用中使用含有亚硝酸盐的废水反硝化液与剩余污泥共同处理，可节约亚硝酸盐的药剂成本，不会造成总氮污染，同时，避免了高铁含量污泥的产生。

2.3 亚硝酸盐促进剩余污泥水解的新原理
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通过在剩余污泥厌氧消化体系中投加亚硝酸盐，促进了污泥减量化和甲烷的产生，这与Lu等^[8]的研究结论一致。在以往的报道中认为，亚硝酸盐投加后剩余污泥的发酵过程包括4个步骤：1)污泥颗粒的增溶；2)溶解性底物的水解；3)水解产物的酸化；4)酸化产物的产甲烷作用^[29]。污泥减量化和甲烷产率的提高归因于亚硝酸盐对微生物细胞壁和EPS的破坏导致有机物释放^[9]，及生物反硝化过程促进有机物水解引起VFAs积累。然而，异化铁还原过程也能参与促进复杂有机物的降解，因此，亚硝酸盐对污泥体系中铁价态的影响不可忽略。笔者提出了亚硝酸盐促进剩余污泥水解过程的新原理：NO₂^-化学反硝化耦合Fe(Ⅱ)氧化，产生的Fe(Ⅲ)能继续参与到异化铁还原作用，耦合小分子有机酸或大分子的蛋白、芳香烃等有机物的降解，这会加速剩余污泥的水解并为产甲烷阶段提供更多可利用的底物。理论上，1 mg/L NO₂^--N的反硝化过程能消耗1.72 mg/L的COD^[30](式(4)~(5)^[31])，研究中共添加了243.48 mg/L的NO₂^--N，50 d内比空白组带来更多(2 485 mg/L)的COD去除，远大于理论上418.79 mg/L的COD，而实际上，几乎97%的NO₂^-用于氧化Fe(Ⅱ)，而Fe(Ⅲ)还原过程的发生和铁还原菌被富集都说明，投加亚硝酸后，Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅲ)的氧化还原在促进剩余污泥水解中起到了至关重要的作用。

$ \frac{1}{4} \mathrm{O}_{2}+\mathrm{H}^{+}+\mathrm{e}^{-} \longrightarrow \frac{1}{4} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} $

(4)

$ \frac{1}{3} \mathrm{NO}_{2}^{-}+\frac{3}{4} \mathrm{H}^{+}+\mathrm{e}^{-} \longrightarrow \frac{2}{3} \mathrm{~N}_{2}+\frac{1}{6} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} $

(5)

3 3结论
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向剩余污泥中投加亚硝酸盐，可显著促进剩余污泥细胞破壁，大幅提升水解酸化效率，对比空白组，甲烷累计产量提升86%，VSS去除量提高21%。投加亚硝酸盐除引起生物反硝化外，可化学氧化污泥中97.3%Fe(Ⅱ)，引发Fe(Ⅲ)还原过程，进而富集铁还原菌，对污泥水解和后续厌氧消化起到重要促进作用。未来的研究中，可对亚硝酸盐反硝化及Fe(Ⅲ)还原对污泥厌氧消化的贡献进行量化分析。

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