有色溶解性有机质(CDOM)是由腐殖酸、富里酸和芳香烃等组成的复杂有机质，也是水体中天然有机质的重要组成成分[1]。CDOM是水生态系统中重要的碳赋存形式之一，对生物地球化学循环、能量流动及水质安全有着重要的影响[2-3]。由于自身的吸附性和络合性，CDOM还是水体中有机污染物和重金属的重要载体[4-5]，对污染物的归趋、毒性效应和生物有效性有着深远影响[6]。CDOM常被用来表征湖泊、水库等水体的富营养化程度[7]，过量的CDOM输入会对水源水质造成威胁[8]。此外，高浓度的CDOM还可能与水处理中的氯发生反应，生成卤乙酸和三卤甲烷等致癌物质[9]，并为饮用水中细菌的生长提供碳源[10]，从而影响人类健康[11]。可见，控制水体中的CDOM含量对水环境保护和饮用水安全都具有十分重要的意义。
植物修复技术因其效果好、成本低、无二次污染等特点，有望应用于环境中CDOM面源污染的控制与治理以及污水处理厂尾水中CDOM的深度净化。Cano等[12]研究表明，种有红鸟蕉和纸莎草的湿地系统比无植物对照组的脱色效果高出20%~21%。Huang等[13]研究证实，使用海马齿的植物浮床技术可以有效去除水体中CDOM，且根际效应起到主要作用。A等[14]发现芦苇湿地系统对污水中腐殖酸的脱色效果(76%~90%)显著高于无植物湿地系统(59%~86%)。因此，有必要进一步研究植物对CDOM的脱色原理以及CDOM在植物根际的环境行为。
笔者以常见湿地植物芦苇(Phragmites australis)为受试植物，以腐殖酸为代表性CDOM，旨在通过CDOM在芦苇根际的脱色、分布和组成分析，探究植物对CDOM的脱色性能，以及CDOM在根际环境的分布特征与组成成分；通过芦苇根系分泌物的脱色实验，考察植物根系分泌物对CDOM脱色的影响；通过芦苇酶提取液的脱色实验，了解植物酶对CDOM脱色的作用。研究结果有助于揭示CDOM在植物根际的脱色机理及其环境行为，为植物修复CDOM的研究和应用提供技术支持和理论依据。
向每个玻璃瓶中添加500 mL浓度为50 mg/L的腐殖酸钠(Sigma Aldrich，上海)溶液，然后移入3株长势相同的芦苇幼苗。所有玻璃瓶用锡纸包裹进行遮光处理，并置于温室条件(24 ℃、1 950 lx、16 h light/8 h dark)下进行为期82 d的植物水培实验。实验共设置3个处理组：1)有植物且添加腐殖酸的植物-有机质实验组；2)有植物且不添加腐殖酸的植物对照组；3)无植物且添加腐殖酸的有机质对照组，每组设两个平行。实验期间在82 d里连续采样13次，每次采样10 mL测定色度，且采样前补充蒸发掉的水量并搅拌均匀，以避免水分耗损对色度的影响。色度的定量以390 nm波长下的吸光度换算得到[14]。
待CDOM脱色效果实验结束，立即回收芦苇的根系、根系附着物及容器底部沉淀物。将上述3种样品放入烘箱干燥(65 ℃，48 h)后称重。使用0.02 mol/L的NaOH作为CDOM洗脱液，根系样品使用30 mL洗脱液洗脱至洗脱液没有色度为止(n=7)(n为采样次数)，根系附着物和容器底部沉淀物样品均使用10 mL洗脱液洗脱至洗脱液没有色度为止(n=5)，然后测定所有样品洗脱液的色度。
待CDOM脱色效果分析结束，立即回收植物-有机质实验组和有机质对照组的剩余溶液；待CDOM分布特征分析结束，立即回收植物-有机质实验组和植物对照组的根系洗脱液。将上述样品调节到pH值为8.0、色度为20 CU的状态后，用超滤离心管(Amicon Ultra-4、Milipore、美国)超滤，然后计算滤液中5种不同截留分子量(3 000、10 000、30 000、50 000、100 000 NMWL)的浓度来分析不同样品中CDOM的组成成分，具体操作步骤参照超滤离心管的使用说明书。
芦苇根系分泌物的制备分为两部分：1)水溶性分泌物样品的制备：待CDOM脱色效果实验结束，立即回收植物-有机质实验组的芦苇根，并称取一定湿重(11.7 g)的根系样品；将根系样品浸入200 mL超纯水中，置于振荡培养箱((28±1) ℃、120 r/min、3 min)内振荡以清洗根系附着物；将根系样品取出，重新浸入200 mL超纯水中，置于人工气候培养箱((28±1) ℃、8 000 lx、16 h light/8 h dark)内静置培养1 d；将根系样品取出，并将剩余溶液经0.2 μm醋酸纤维膜针头过滤器(DISMIC-25CS，ADVANTEC，日本)过滤，所得滤液作为水溶性分泌物样品。2)根系附着分泌物样品的制备：将上述根系样品浸入100 mL超纯水中，使用超声粉碎机和旋转震荡仪交替进行超声(20 kHz、130 W、1 min)和振荡各6次；将根系样品取出，并将剩余溶液经0.2 μm醋酸纤维素膜针头过滤器过滤，所得滤液作为根系附着分泌物样品。
将上述水溶性分泌物样品和根系附着分泌物样品经冷冻干燥机浓缩干燥后，分别复溶于乙腈中，制成5倍浓缩根系分泌液。取0.5 mL上述浓缩液和4.5 mL浓度为50 mg/L的腐殖酸钠溶液(pH值8.0)混合，然后注入褐色试管中，并置于振荡培养箱(25 ℃、100 r/min)内培养。同时设置不添加根系分泌液的空白对照一起培养。连续4 d定时采取0.1 mL水样进行吸光度测定，以390 nm波长下的吸光度换算成色度(CU)，以465、665 nm波长下吸光度的比值(E4/E6)来表征CDOM的腐殖化程度。E4/E6值越小，表明CDOM的芳香性越高、分子量越高[15]。
待CDOM脱色效果实验结束，立即回收植物-有机质实验组的芦苇根，并称取湿重240 mg的根系样品。使用P-PER植物总蛋白抽提试剂盒(P-PER Plant Protein Extraction Kit，Thermo Scientific，美国)抽提芦苇根系的组织蛋白，所得溶液作为植物酶提取液。取酶提取液按照0%、1%、5%的体积比与50 mg/L腐殖酸钠溶液(pH值8.0)混合，然后注入褐色试管中，并置于振荡培养箱(20 ℃、100 r/min)内培养。连续2 d定时采取0.1 mL水样，并在390、465、665 nm波长下测定吸光度并计算其色度与E4/E6值。
不同处理组中芦苇对CDOM的脱色效果见图 1。在整个实验过程中，植物-有机质实验组表现出较好的脱色效果(84%)，在前40 d，植物便将色度从244 CU降至50 CU，此后色度稳定在37~44 CU之间。植物对照组因为没有添加CDOM，其初始色度接近于零(2.6 CU)，但随着实验的进行，其色度缓慢上升到17 CU，这可能是植物释放的分泌物中含有CDOM所致，但整体色度变化不大，可以忽略不计。有机质对照组因为缺少植物的作用，色度在82 d里仅从251 CU下降到213 CU。可见CDOM的自然水解速度十分缓慢，其脱色效应主要依赖于植物的作用。一方面，植物可以通过直接吸收和吸附CDOM来减少其环境含量；另一方面，植物根系可以为微生物提供生长介质，从而间接促进CDOM的生物降解。
植物根系、根系附着物及容器底部沉淀物中CDOM提取液的色度见图 2。根系吸收、根系附着、沉淀物中CDOM色度分别为4.6×106、3.8×105、4.0×103 CU，且色度在这3种组分中的占比依次为92.20%、7.71%、0.08%。由此可见，CDOM大部分被根系吸收到植物体内，少部分吸附在植物根表，只有极少量残渣与根系分泌物共同絮凝沉降在容器底部。虽然浓度相差甚远，植物-有机质实验组和植物对照组中CDOM的分布规律基本一致，说明植物本身也含有一定量的CDOM[16]，且植物对不同浓度CDOM的去除方式均为根系吸收为主、根表吸附为辅。
脱色处理液中CDOM不同分子量占比如图 3(a)所示。有机质对照组中高分子CDOM(分子量>100 kDa)的占比(67%)高于植物-有机质实验组(33%)，表明植物可以促进CDOM分解，从而达到低分子化的效果。然而，有机质对照组中低分子CDOM(分子量 < 10 kDa)的占比(21%)也高于植物-有机质实验组(11%)，这可能是因为低分子有机质容易被植物吸收，从而转移进入植物体内[17]。
根系洗脱液中CDOM不同分子量占比如图 3(b)所示。植物对照组中低分子CDOM(分子量 < 30 kDa)的占比(37%)低于植物-有机质实验组(43%)，特别是植物-有机质实验组中发现了低分子CDOM(分子量 < 3 kDa)(8%)，而植物对照组中没有(0%)，说明只有低分子有机质才能通过细胞膜进入植物体内，这进一步解释了图 3(a)中植物-有机质实验组的脱色处理液中低分子CDOM含量少的原因。
根系分泌液脱色实验结果如图 4所示。随着时间的推移，CDOM的色度和E4/E6值在不同根系分泌物中均十分稳定，分别为249~290 CU和3.5~4.6(水溶性分泌物)、322~353 CU和3.2~4.0(根系附着分泌物)、245~280 CU和4.0~5.0(无添加对照样)。其中，水溶性分泌物的色度范围与无添加对照样非常相近，但低于根系附着分泌物；而根系附着分泌物的E4/E6值则略低于另外两种。由此可知，不但芦苇根系分泌物对CDOM的脱色及其腐殖化过程均无直接影响，而且植物分泌的CDOM分子量较大，附着在植物根表上不易随水流动，这与前面发现的低分子CDOM易被吸收进入植物体内的结果相呼应。
酶提取液脱色实验的结果如图 5所示。随着酶提取液添加量的提高，CDOM的反应呈现如下规律：在无添加对照样中，色度从217 CU上升到246 CU，且E4/E6值从5.9下降到5.5；在1%酶提取液添加样中，色度和E4/E6值均十分稳定，分别为250 CU和5.6；而在5%酶提取液添加样中，色度从321 CU下降到288 CU，且E4/E6值从2.7上升到4.1。表明植物酶可以作用于CDOM的低分子化进程，从而起到脱色的效果，这就解释了在CDOM组成成分分析中观察到植物能够使CDOM低分子化的原因。
在自然水解条件下，CDOM难以发生脱色反应，其有效脱色依赖于植物作用。绝大部分CDOM累积在植物体内，少量吸附在根系表面，只有极少量与根系分泌物共同絮凝沉淀。因此，植物以根系吸收为主、根表吸附为辅的途径对CDOM进行脱色，这就决定了CDOM在植物不同组分中的分布规律；高分子有机物(分子量>3.5 kDa)容易附着在植物细胞壁上，而低分子有机物(分子量 < 3.5 kDa)可以通过植物细胞膜进入植物体内[17]。这与本研究的结果相一致，可见植物的存在有助于CDOM的低分子化，而这些低分子CDOM易被根系吸收进入植物体内。
虽然研究发现根系分泌物对CDOM的脱色反应并无明显影响，但这并不表示它毫无作用。一方面，根系分泌物可以作为碳源而被微生物直接利用[18]；另一方面，植物释放的有机酸不但能够使细胞表面吸附的腐殖酸结构发生变化[15]，而且可以刺激植物根系生长与ATP合成酶生成[19-20]。由此认为，植物根系分泌物并不是直接作用于CDOM的脱色过程，而是通过改变CDOM的形态结构以增强其生物可利用性，以及刺激相关功能菌的富集，从而促进CDOM的生物降解[21-23]。此外，植物的存在不但可以通过提供生长介质、释放营养物质和氧气等根际效应来改善根际微生物的生长条件[24]，而且可以通过生成过氧化物酶等代谢酶来促进CDOM的低分子化过程[25]。
结合植物脱色实验和已知的微生物相关特性，图 6汇总了CDOM在芦苇根际的脱色机理：1)高分子CDOM吸附在根表的细胞壁上，低分子CDOM通过细胞膜进入植物体内；2)植物的存在为微生物的富集提供了适宜的界面和微环境；3)CDOM的存在为植物和根际微生物的生长提供了碳源；4)植物释放的根系分泌物可以改变CDOM结构，增强微生物活性；5)步骤2)~4)均有利于附着在植物根表的CDOM发生生物降解，从高分子有机质分解成低分子有机质；6)经低分子化过程的CDOM被根系吸收进入植物体内，从而被植物酶进一步代谢分解。
1) CDOM难以发生自然水解，其有效脱色依赖于植物作用。以根系吸收为主、根表吸附为辅的植物作用途径决定了CDOM大量累积于植物体内、少量附着在植物表面的分布特征。其中，高分子CDOM往往附着在植物细胞壁上，而低分子CDOM能够通过细胞膜进入植物内。
2) 植物根系分泌物不能直接作用于CDOM的脱色反应，但可以通过提供生长介质和碳源促进根际微生物生长、改变CDOM形态结构以改善其生物可利用性，以及富集相关降解菌群强化生物降解功能等方式来间接调控CDOM的脱色降解过程。
3) 吸附在根系表面的高分子CDOM能作为碳源被根际微生物利用，经降解变成低分子CDOM后可通过根系吸收进入植物体内，并受到植物酶的代谢作用被进一步分解矿化，从而完成植物对CDOM的净化作用。
2022, Vol. 44 Issue (3): 119-125 doi: 10.11835/j.issn.2096-6717.2021.158 
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2022, Vol. 44 Issue (3): 119-125 doi: 10.11835/j.issn.2096-6717.2021.158 PDF