污水生物脱氮是目前水处理领域的重要问题，传统的生物脱氮工艺不能满足低C/N高氨氮废水的处理要求，而自养脱氮因其高效低耗，且在整个脱氮过程中不需要有机碳源而备受关注。但该工艺距离废水生物脱氮的实际应用还很远，因为实际废水成分复杂，尤其是有机碳源的存在。尽管有报道表明，有机碳源的存在对ANAMMOX细菌极为不利^[1-5]，但也有研究证实，氨氮、COD可以在一个反应器中通过亚硝化-ANAMMOX途径、传统反硝化途径得以去除^[6-7]。COD浓度是影响厌氧氨氧化过程和反硝化过程的重要参数之一。但至今，学术界就碳源水平对ANAMMOX抑制尚不明晰，Güven等^[8]认为当C/N比大于1时，ANAMMOX菌将失去与异养反硝化菌竞争的优势，而Pathak等^[9]认为C/N在0.6左右，异养反硝化菌较ANAMMOX菌处于优势地位。另外，对有机碳源条件下，反硝化等异养菌与ANAMMOX菌竞争机制观点也不一致。有些学者认为，在一定的C/N比范围内，反硝化菌等异养菌和厌氧氨氧化菌共存并形成基质竞争，有机物浓度高时，异氧菌大量繁殖，厌氧氨氧化菌不再表现活性^{[2, 5, 10]}。也有学者指出，有机碳源条件下，厌氧氨氧化菌仍然占据重要生态位，和反硝化菌竞争并优先利用有机碳源，代谢途径表现多样化^{[1, 8, 11]}；还有学者认为反硝化能消耗有机物，产生CO₂为厌氧氨氧化解毒，同时提供无机碳源；厌氧氨氧化能产生硝氮，为反硝化提供电子受体，两者可实现协同作用^[12-14]。甚至有学者指出两者之间并无竞争^[15]。

从以上可以看出，有机物在厌氧氨氧化过程中的作用及厌氧氨氧化菌与反硝化菌相互作用机制存在争议。用单级自养脱氮工艺处理含氮有机废水时，厌氧氨氧化菌能否维持优势菌的地位还有待进一步探讨。笔者考察了以不含有机碳源配水和低C/N有机废水为基质的2个反应器，对稳定运行的单级自养脱氮反应器脱氮性能及脱氮途径进行对比分析；进一步利用PCR-DGGE技术，研究了2个反应器中生物膜及悬浮活性污泥微生物群落结构的差异，寻求进水有机质条件的改变对系统微生物层面的影响，以期为该工艺应用于工程实践提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 实验装置运行及处理效果

本试验是在前期已成功构建的单级自养脱氮系统的基础上进行的，实验装置如图 1所示。采用2组SBBR反应器(反应器A和反应器B)分别研究无机废水和低C/N比有机废水对单级自养脱氮系统的脱氮性能和微生物群落结构的影响。反应器采用间歇进出水方式运行，每天换水2次，每次换水量为反应器容积的1/2，出水经沉淀后污泥回流至反应器中，HRT为48 h。与连续曝气相比，间歇曝气方式更有益于创造单级自养脱氮所需的环境^[16]，因此本研究沿用间歇曝气方式。A、B反应器的进水水质见表 1。A反应器的pH控制在7.8~8.5、水温控制在(30±2) ℃、DO控制在2.0~2.5 mg/L (曝气)/0.2~0.4 mg/L (停曝气)、曝/停比为2 h:2 h。B反应器DO控制1.4~1.7 mg/L (曝气)/0.2~0.4 mg/L (停曝气)，其他控制条件与A反应器完全相同。

1.2 测试项目及分析方法 1.2.1 理化指标的测试

pH：美国HACH公司pH计；DO：美国HACH公司LDO^TMHQ10溶氧仪；NH₄⁺-N：纳氏试剂分光光度法；NO₂^--N：N-1-萘乙二胺分光光度法；NO₃^--N：紫外分光光度法；TN：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；COD：重铬酸钾消解-紫外分光光度法。

1.2.2 微生物群落结构分析

1) 样品的准备及DNA提取参见文献[17]。

2) PCR-DGGE分析。总细菌的扩增采用V3区通用引物进行扩增^[18]；ANAMMOX细菌采用巢式PCR进行扩增，扩增引物及程序见文献[19]。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖电泳检测。

取上述PCR产物各30 μL，在The Dcode^TM Universal Mutation Detection System (U.S.A，Bio-Rad Co.)进行电泳分析。聚丙烯酰胺变性梯度胶浓度为8%(丙烯酰胺与双丙烯酰胺的质量比为37.5:1)。其中细菌的变性梯度范围为35%~55%(100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺)；ANAMMOX菌的变性梯度为：35%~60%。运行条件为：在1×TAE电泳缓冲液中，60 ℃条件下，200 V运行10 min，然后100 V运行13 h，电泳完成后，用0.5 μg/mL的溴化乙锭染色20 min，再用去离子水漂洗2次，然后在BIO-RAD Versa Doc IMAGING SYSTEM系统内观察电泳结果并照相。

3) 克隆、测序。切下清晰条带，置于1.5 mL离心管中，加入无菌水30 μL，用灭菌牙签捣碎胶条，-4 ℃浸泡过夜，取溶液作为模板，再次进行PCR扩增，引物及反应条件同上。二次PCR产物用凝胶纯化试剂盒纯化后连接到pMD18-T载体上，转化到E. coli JM109中，克隆经M13通用引物检测后，挑取阳性克隆子测序，测序结果于NCBI数据库上进行比对分析，寻找同源性高的序列。

4) 数据处理。使用软件Quantity One-1-D软件分析DGGE分离图像。微生物群落多样性采用Shannon指数(H)指数表示^[20]，公式为$H = - \sum {Pi\lg Pi} $，其中H的计算是基于DGGE条带的位置和强度。条带相似性系数可以用Sorenson配对比较相似性系数C_S^[21]，公式为C_S=2L_AB/(L_A+L_B)×100，L_AB为泳道A与泳道B位置相同的条带数，L_A为泳道A上的条带数，L_B为泳道A上的条带数。经PAST软件统计分析得到系统样品的Shannon多样性指数(H)数据及相似性系数C_S。

2 结果与分析 2.1 反应器脱氮性能比较

A反应器内氮转化关系如图 2所示。在监测的60多天内，该反应器NH₄⁺-N出水质量浓度最高值为10.78 mg/L，最低的几天低于检测限；出水NO₂^--N最高值为6.8 mg/L，最低则低于检测限；出水NO₃^--N介于15~25 mg/L；TN则稳定在25 mg/L左右，NH₄⁺-N转化率稳定在93%以上，TN的去除率则在81%~87%之间。

B反应器内氮转化关系如图 3所示。在试验过程中，B反应器NH₄⁺-N出水质量浓度低于2 mg/L，几乎检测不到NO₂^--N，出水NO₃^--N介于12~38 mg/L，出水TN稳定在13~39 mg/L，系统NH₄⁺-N转化率高达99%以上，TN去除率稳定在84%~95%范围。

DO对SBBR单级自养脱氮系统的脱氮性能和运行稳定性有重要影响。之前的研究结果显示，A反应器DO控制在2.0~2.5 mg/L (曝气)/0.2~0.4 mg/L (停曝气)时，系统脱氮效果最佳^[16]。而在相同的DO条件下，B反应器NH₄⁺-N转化率为77%~90%，TN去除率仅为46%~57%，出水NO₃^--N较高；降低DO至1.4~1.7 mg/L (曝气)/0.2~0.4 mg/L (停曝气)，经一段时间的培养，B反应器运行稳定且脱氮性能大幅提高。

2.2 反应器脱氮途径分析

A、B反应器均存在多种脱氮途径，笔者重点考虑亚硝化-厌氧氨氧化和传统硝化反硝化2个主要的脱氮途径，结果如表 2所示。A反应器以亚硝化-厌氧氨氧化自养脱氮占主导作用，为90.7%，传统反硝化途径仅占3.73%，数据来源于课题组前期对单级自养脱氮系统脱氮途径的研究^[22]。

B反应器存在的脱氮过程如下^[23]：

$ {\rm{NH}}_4^ + + 1.5{{\rm{O}}_2} \to {\rm{NO}}_2^ - + {{\rm{H}}_2}{\rm{O}} + 2{{\rm{H}}^ + }, $

(1)

$ {\rm{NO}}_2^ - + 0.5{{\rm{O}}_2} \to {\rm{NO}}_3^ - , $

(2)

$ \begin{array}{l} {\rm{NH}}_4^ + + 1.32{\rm{NO}}_2^ - + 0.066{\rm{HCO}}_3^ - + 0.13{{\rm{H}}^ + } \to \\ 1.02{{\rm{N}}_2} + 0.26{\rm{NO}}_3^ - + 0.066{\rm{C}}{{\rm{H}}_2}{{\rm{O}}_{0.5}}{{\rm{N}}_{0.15}} + 2.03{{\rm{H}}_2}{\rm{O}}, \end{array} $

(3)

$ {{\rm{C}}_6}{{\rm{H}}_{12}}{{\rm{O}}_6} + 8{\rm{NO}}_2^ - \to 4{{\rm{N}}_2} + 6{\rm{C}}{{\rm{O}}_2} + 2{{\rm{H}}_2}{\rm{O}} + 8{\rm{OH}}, $

(4)

$ \begin{array}{l} 5{{\rm{C}}_6}{{\rm{H}}_{12}}{{\rm{O}}_6} + 24{\rm{NO}}_3^ - \to 12{{\rm{N}}_2} + 30{\rm{C}}{{\rm{O}}_2} + \\ 18{{\rm{H}}_2}{\rm{O}} + 24{\rm{OH}}。\end{array} $

(5)

反硝化的C/N(η)与微生物的细胞产率系数Y_c的关系^[12]如下：

$ {\eta _1}{\rm{ = COD}}/{\rm{NO}}_3^ - - {\rm{N}} = 2.857/\left( {1 - 1.628{Y_{\rm{c}}}} \right), $

(6)

$ {\eta _2}{\rm{ = COD}}/{\rm{NO}}_2^ - - {\rm{N}} = 1.714/\left( {1 - 1.628{Y_{\rm{c}}}} \right)。$

(7)

以葡萄糖为电子供体时，异养反硝化菌的细胞产率系数Y_c≈0.15^[24]。由此可得，η₁≈3.8，η₂≈2.3。其中式(2)NO₂^-被氧化为NO₃^-的量忽略不计，这是一方面，鉴于好氧氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的氧饱和系数不同，DO在0.5~1.7 mg/L的范围内有利于亚硝态氮的积累^[25]；另一方面，间歇曝气也有利于亚硝态氮的积累。Pollice等^[26]研究了充氧方式对序批式反应器硝化性能影响，结果表明：连续曝气保持DO在2.0 mg/L以上时，亚硝酸盐和硝酸盐同时积累；间歇曝气(每20 min曝气10 min)使DO在曝气时达到2.0 mg/L，停止曝气5 min后降至0.01 mg/L，亚硝酸盐得到积累，而硝酸盐产量很少。Kornaros等^[27]也证实周期性缺氧对AOB菌没有明显的影响，但严重抑制NOB菌的生长，并且抑制程度与缺氧时间成正比。本研究DO控制在1.4~1.7 mg/L，曝停比为2 h:2 h，实验条件有利于将反应控制在亚硝态阶段。

根据式(1)~式(7)，从COD、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N和TN之间量的变化关系，结合质量平衡原理，理论推导B系统2种脱氮途径在系统氮去除中所占比例(见表 2)，其中亚硝化-厌氧氨氧化自养脱氮脱氮途径占50.78%，传统硝化反硝化途径对TN去除率占49.22%。

单级自养脱氮工艺在不投加有机碳源的条件下利用亚硝酸细菌与厌氧氨氧化菌的协同作用实现NH₄⁺的去除，A反应器中不断有细菌死亡，反硝化菌仍然可以利用这些死细菌进行异养反硝化，把单级自养脱氮系统的NO₂^-转化为NO、NO₂和N₂O等，并从中获得能量使自身得到增殖。与ANANMMOX菌相似，反硝化菌也需要在缺氧的环境下生长。因此，A反应器中部分NH₄⁺可能是通过传统硝化反硝化途径去除。B反应器中由于进水含有机碳源，异养菌增殖并与ANANMMOX菌竞争生存空间，使得ANAMMOX对TN去除贡献率降低，反硝化作用得以强化。

2.3 反应器微生物群落结构比较

DGGE图像中，每条条带代表一种不同的微生物，条带越多，表明系统中微生物种群结构越复杂，反之则越简单，因此，在一定程度上条带的多寡可以反映系统中微生物种群的多样性程度。Shannon多样性指数(H)是反映丰富度和均匀度的综合指标；相似性系数Cs反应了样品间的相似程度。一般而言，H值越大，物种多样性越丰富；Cs值越大，2个样品间相似程度越高。DGGE图谱及统计分析结果分别见图 4、表 3、表 4，其中A₁、A₂分别代表A反应器的活性污泥、生物膜样品，B₁、B₂分别代表B反应器的活性污泥、生物膜样品。

从图 4可以看出，与A反应器相比，B反应器微生物群落结构发生了较大变化。A反应器中活性污泥样品和生物膜样品条带数分别为14和18条，Shannon多样性指数(H)分别为2.374、2.513；B反应器分别为16和24条，Shannon多样性指数(H)分别为2.449、2.928。这一结果表明有机碳源使得B反应器微生物更加丰富，尤其是生物膜。由于A反应器进水不含有机碳源，系统中异养菌在与自养菌竞争中处于劣势，其微生物结构相对简单。B反应器COD的去除率稳定在90%左右，传统反硝化途径所占比例较A反应器大幅提高，但亚硝化-厌氧氨氧化途径仍占主导地位，表明有机碳源的存在，使得系统中异养菌大量增殖，形成一个好氧硝化菌、厌氧氨氧化菌和异养反硝化菌共存的系统，微生物群落结构变得复杂。而生物膜结构使得反应基质和DO在其内部纵向分层分布，有利于形成好氧与厌氧共存的微环境，为微生物的生长提供有利的条件，使得膜系统内的微生物种类和种群数量都大大提高。

A反应器内活性污泥(A₁)和生物膜(A₂)间相似性系数Cs值为50%，而B反应器内二者(B₁和B₂)的Cs值更高，为70%。生物膜结构有利于基质和DO在生物膜内梯度分布，形成不同的微环境，使得活性污泥和生物膜之间微生物种群结构存在差异。A反应器为无机系统，微生物群落结构相对简单，在活性污泥和生物膜外部以AOB菌为主，内部ANAMMOX菌占优，表现为群落结构差异明显。B反应器有机碳源的存在，异养菌增殖，AOB菌、好氧反硝化菌、异养反硝化菌及ANAMMOX菌在活性污泥和生物膜内按各自的生态位竞争生存空间，两者表现为较高的相似性。A、B反应器活性污泥(A₁和B₁)间的Cs为46.6%，生物膜(A₂和B₂)间的Cs指数为61.9%。有机碳源的加入使得B反应器异养菌增殖，活性污泥中部分自养菌被“淘洗”；而由于生物膜分层结构形成不同的微环境，在生物膜表面以好氧异养菌、好氧亚硝化菌为主，生物膜内部的厌氧区ANAMMOX菌占主导地位，因此，尽管与A反应器相比，B反应器生物膜微生物种类增加最为明显，但与活性污泥相比，Cs值较高。

2.4 ANAMMOX菌的验证

为验证单级自养脱氮系统在有机碳源条件下, ANAMMOX菌可以和异养菌竞争, 并占据一定的生态位，采用巢式PCR-DGGE技术对反应器中与ANAMMOX菌亲缘关系较近的planctomycetes进行研究，实验结果见图 5。从图上可以看出，与A反应器相比，B反应器菌群结构发生了变化，多样性增加，表明有机碳源的存在有利于与planctomycete.sp相似性较高的ANAMMOX菌群的富集；条带a和b位置为A、B反应器所共有，但亮度有所不同；经TA-克隆，测序比对，发现条带a、b均为planctomycetes属的ANAMMOX细菌，其中条带a与Uncultured planctomycete clone Amx-PO55-10(GQ356057)相似性达98%，与Candidatus Brocadia sp (HM769652)相似性达97%；条带b与Uncultured anaerobic ammonium-oxidizing bacterium(AB164477)相似性达100%。

3 讨论

目前，尽管已有单级自养脱氮工艺应用于废水处理实际工程的尝试^[28]，但完全意义上应用于废水生物脱氮还存在许多问题，特别是有机物对ANAMMOX菌的干扰。到目前为止，针对厌氧氨氧化工艺的研究大多是在无机碳源的条件下进行的。有关ANAMMOX与反硝化协同脱氮作用研究还较少，因反应器类型、进水条件等的不同，研究结论也不尽一致。

理论上，有机碳源的加入，对自养脱氮系统厌氧氨氧化菌存在两方面的制约作用。一方面，有机碳源存在，使得系统好氧异养菌繁殖，抑制亚硝化菌的活性。Mosquera-Corral等^[29]在对SHARON工艺的研究中发现，当C/N从0.2增加到0.3时，NO₂^--N的积累率从60%降至20%。另一方面，从热动力学角度看，与厌氧氨氧化相比，反硝化反应更利于进行，并且厌氧氨氧化菌因其产率低、生长速率慢等特点，缺乏竞争力；同时反硝化菌与ANAMMOX菌竞争底物——亚硝酸盐，导致厌氧氨氧化菌活性降低。Chamchoi等^[10]发现当UASB反应器进水C/N比为0.9，COD为100~200 mg/L时，ANAMMOX菌在与异养反硝化菌竞争中占优，随着COD质量浓度的增加，异养菌大量增殖，当反应器进水COD为300 mg/L时ANAMMOX菌失活，甚至消失。Molinuevo等^[5]用半连续UASB反应器处理猪场粪便废水，发现有机物的存在会导致ANAMMOX性能下降；当进水COD大于292 mg/L时，ANAMMOX菌完全受到抑制。本研究采用SBBR反应器，进水COD质量浓度245~295 mg/L，NH₄⁺-N质量浓度240~255 mg/L，C/N比为1.2时，控制DO为1.5 mg/L左右进行间歇曝气时，可达到同时脱氮除碳的效果，此时通过亚硝化-ANAMMOX途径去除的NH₄⁺仍占主导地位。因此，COD对ANAMMOX菌抑制的质量浓度应该更高，有关COD对厌氧氨氧化菌的抑制水平有待进一步研究。

目前反硝化与厌氧氨氧化耦合脱氮的研究多是基于简单的计量学模型或质量平衡法估算的，但是该系统微生物复杂，代谢类型多样，计量学模型结果往往偏差较大；Wang等^[30]在处理垃圾渗滤液时，发现在进水COD平均值554 mg/L，NH₄⁺-N质量浓度634 mg/L，C/N比为0.87时，可实现同步亚硝化、厌氧氨氧化与反硝化，此时氨氮去除率为80%，COD去除率仅为28%，其中TN通过亚硝化-厌氧氨氧化去除的占68%，8%的TN通过异养反硝化去除的，异养反硝化对COD的去除占COD去除的23%，5%通过其他异养菌去除的。吕永涛等^[31]研究了不同有机物浓度对厌氧氨氧化活性及脱氮性能的影响，结果表明：当有机物浓度过高时，ANAMMOX对TN去除贡献率持续降低，反硝化不断得到强化。本研究关于B反应器脱氮途径研究中，异养反硝化脱氮途径结果可能略偏大，自养脱氮途径所占比例可能偏小，这是由于一方面COD的去除除异养反硝化途径外，还可能存在其他异养菌的作用；另一方面系统中存在亚硝化氧化反应，传统硝化反硝化较亚硝化-反硝化所消耗的碳源较多。不过通过A、B反应器脱氮途径对比，可以发现：B反应器ANAMMOX途径对总氮去除的贡献率有所降低，但仍占主导地位。Güven等^[8]认为当C/N比大于1时，ANAMMOX菌将失去其与异养反硝化菌竞争的优势。本研究C/N比为1.2，此时具有ANAMMOX功能的planctomycete.sp菌得到富集，与异养反硝化菌既竞争中仍占优势地位。反硝化异养菌以厌氧氨氧化副产物NO₃^--N为电子受体，两者协同作用，使B反应器变现出优越的脱氮除碳性能。

分子生物学研究表明，含有机碳源的系统内微生物群落结构更加丰富，生物膜尤为明显。从DGGE图谱上，可以看到某些条带是A、B反应器共有的，某些仅出现在A或B反应器中，它们在系统中的作用如何，还有待进一步研究。目前关于ANAMMOX与反硝化协同脱氮反应器内微生物种群变化研究还很少。Chen等^[7]采用FISH技术对NRBC反应器功能性微生物的分析表明，AOB及好氧异养菌分布在生物膜表面，ANAMMOX菌和反硝化菌分布在SNAD生物膜内部。Xiao等^[32]采用SBBR反应器处理垃圾渗滤液时，采用PCR-DGGE技术对微生物群落研究结果表明，AOB、NOB，好氧反硝化菌、异养反硝化菌及ANAMMOX菌在生物膜内共存。诸多研究结果均表明，相比于活性污泥絮体，生物膜结构有利于实现ANAMMOX及与反硝化协同脱氮。COD浓度是影响ANAMMOX菌与反硝化菌竞争基质的重要因素之一，对不同COD浓度下微生物种群演替的研究或许可为ANAMMOX与反硝化协同脱氮反应器启动及运行提供理论依据。

目前，关于ANAMMOX与反硝化的协同脱氮研究多见于理论研究、序批式实验，对有机环境下自养脱氮系统的稳定性、反硝化存在对脱氮性能的影响，以及反硝化菌与厌氧氨氧化菌之间竞争、协同关系，还有待于进一步研究。

4 结论

1) 单级自养脱氮系统在进水NH₄⁺-N质量浓度为160 mg/L，DO控制为2.0~2.5 mg/L (曝气)/0.2 ~0.4 mg/L (停曝气)条件下，氨氮转化率稳定在93%以上，总氮的去除率则在81%~87%之间；当进水COD质量浓度245~295 mg/L，NH₄⁺-N质量浓度240~255 mg/L，C/N比为1.2时，控制DO为1.4~1.7 mg/L (曝气)/0.2~0.4 mg/L (停曝气)，这时NH₄⁺-N转化率高达99%以上，TN去除率介于84%~95%，COD去除率达90%以上，可达到同时脱氮除碳的效果。

2) 当进水不含有机碳源时，系统主要通过亚硝化-ANAMMOX途径去除氨氮；而低碳氮比的进水，使得系统自养脱氮途径去除氨氮的比例下降，传统硝化反硝化途径得到强化，异养反硝化菌与ANAMMOX菌为竞争协作关系。

3) 与无机系统相比，含有机碳源的系统内微生物群落结构更为复杂，其中生物膜表现得尤为明显，这也表明生物膜结构更有利于形成一个厌氧与好氧共存的微环境，在一个反应器内实现全部脱氮过程。